一種人肺炎支原體培養基及其診斷試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種支原體培養基及其診斷試劑盒，尤其是涉及一種人肺炎支原體培 養基及其診斷試劑盒。
【背景技術】
[0002] 被發現近百年的支原體是一類無細胞壁的原核細胞型微生物，介于病毒與細 菌之間。目前已分離到150多種。與人類疾病有關的主要是肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, Mp)、解脈脈原體（Ureaplasma urealyticum,簡稱 Uu)及人型支原體 (Mycoplasma hominis,簡稱Mh)等。Mp早就證明是非典型性肺炎的重要病原菌，診斷難度 大，易引起并發感染，死亡率較高。2003年非典流行后，社區性呼吸道感染流行時，更加引起 醫療界的關注。
[0003] Mp可進入血液，并可在呼吸系統W外的部位增殖，引起肺外并發癥。并發癥多出現 于呼吸道癥狀后3~30山常累及也血管系統、血液系統、中樞神經系統、皮膚及肝腎器官。 隨著對病原的不斷認識和臨床資料的不斷積累，肺外感染的表現也越來越引起臨床醫生的 關注和重視。
[0004] Mp的基因組小，僅是大腸桿菌的1/5~1/4,細胞小（小于lOOnm)且多形，有液體 運動性；菌體集落小于l-2mm，肉眼難見，通常借助40-100倍顯微鏡檢查計數。Mp生長繁殖 的生理生化條件相對簡單而自然地依附宿主組織細胞并有胞內生存的特點，難于人工培養 且生長緩慢；與其他支原體的種間差異大，各有特點可用于分離、鑒別。此等造成臨床診斷、 治療的困難，同時是研發技術的訣菌伏點。
[0005] 國外Mp的培養分離有商品化的Difco、化oid等公司干燥基礎基，法國生物梅里埃 的成品培養基。液體培養常用試管、青霉素安培瓶，固體培養慣用圓形培養皿等，還有雙相 培養的，但是，均對習濕需0)2的支原體的培養都不如人意。
[0006] 商品液體培養基培養于37C -38C，4-7天，有的要10天后觀察出報告。都W變色 判斷結果，有的陽性率低，有的出現假陽性。
[0007] 我國對支原體基礎及醫院實驗診斷的研究起步晚，多模仿國外方法，存在著臨床 培養陽性率低、易污染雜菌、出現假陽性等諸多問題，不能滿足臨床診斷治療的需求；而且 國內各實驗室用于支原體的分離培養基，多數進口，價格昂貴；有的自制，質量不穩定，衛生 管理部口已立法管理，促進研發創新產品。
[0008] Mp常用培養基為PPL0培養基，很多公司都有出售，但血清（常用馬血清或豬血 清）和抗生素自己添加，在液體培養基中通常要加入酷紅做指示劑，當培養基由紅色變為 黃色時，即可判定Mp的生長。實際上，支原體的分離生長難，盲傳幾次，液體培養基變黃后， 在固體培養基上出現典型菌落，才獲得純分離的菌株。
[0009] 微生物學發展中，Mp曾稱為"難養菌"，不但對營養要求嚴格，而且對培養環境中的 濕度、溫度、氧分壓及基質抑等條件也很特殊。Mp生長繁殖的最適抑是7. 4-7. 6,60%~ 80 %濕度環境。
[0010] 傳統的難養菌的分離培養及鑒定的方法，復雜、繁瑣、易于污染、成本昂貴。本發明 是從大量實踐中總結經驗而設計的，試制品能夠滿足臨床診斷的特異性、可靠性要求，同時 達到快速、安全、環保、資源節約。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種人肺炎支原體 培養基及其診斷試劑盒。
[0012] 本發明創新設計新的Mp培養基配方，適用于Mp感染引起非典型性肺炎病原體的 分離培養及鑒別，而獲取病原菌的臨床診斷信息。
[0013] 本發明的目的可W通過W下技術方案來實現：
[0014] 一種人肺炎支原體培養基，包括TSB培養基與添加劑，所述的添加劑包括牛血 清、DMEM、禽蛋黃提取物、丙麗酸軸W及谷氨醜胺，所述的DMEM含量為人肺炎支原體培養基 總含量的5-15% (體積分數），W人肺炎支原體培養基總體積計，所述的牛血清的含量為 lOOml/L，所述的禽蛋黃提取物含量為lO-lOOml/L，所述的丙麗酸軸含量為0. 2-1. Og/L，所 述的谷氨醜胺含量為0. 3-1. Og/L。
[0015] 作為優選，每1000ml人肺炎支原體培養基還含有W下抑菌劑；氨予青霉素1百萬 單位，納他霉素50mg。
[0016] 每lOOOmlTSB培養基含有W下成分：
[0017]
[0018]
[0019] 所述的禽蛋黃提取物中含有維生素A及有機砸，所述的維生素A含量為2~lOu/ ml,所述的有機砸含量為0. 2~2.化pm。
[0020] 作為優選，所述的禽蛋黃提取物還含有微量的不飽和脂肪酸類與磯脂類物質，W 及10-25v/v%的己醇。
[0021] 所述的禽蛋黃提取物制備方法如下：
[0022] (1)取新鮮富砸雞蛋置入7〇v/v%己醇溶液中浸泡30分鐘；
[0023] (2)在超凈工作臺上無菌操作取蛋黃，將蛋黃置于無菌燒瓶中；
[0024] 做向含有蛋黃的無菌燒瓶中W 1 ;2重量比例，加入90v/v%己醇，充分攬拌、混 勻，封閉瓶口后置于4C~8C下，保存20-2化；
[0025] (4)用1N化細調節步驟（3)處理后溶液的抑至7. 0~8. 0,并6000RPM離也，
【主權項】
1. 一種人肺炎支原體培養基，其特征在于，包括TSB培養基與添加劑，所述的添加劑包 括牛血清、DMEM、禽蛋黃提取物、丙酮酸鈉以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量為人肺炎支原體 培養基總含量的5-15% (體積分數），以人肺炎支原體培養基總體積計，所述的牛血清的含 量為100ml/L，所述的禽蛋黃提取物含量為10-100ml/L，所述的丙酮酸鈉含量為0. 2-1. Og/ L，所述的谷氨酰胺含量為0. 3-1. Og/L。
2. 根據權利要求1所述的一種人肺炎支原體培養基，其特征在于，每1000ml人肺炎支 原體培養基還含有以下抑菌劑：氨芐青霉素1百萬單位，納他霉素50mg。
3. 根據權利要求1所述的一種人肺炎支原體培養基，其特征在于，每1000 mlTSB培養基 含有以下成分： 胰蛋白胨 17g; 大豆蛋白胨 3g; 氯化鈉 5g； 磷酸二氫鉀 2.5g; 葡萄糖 2.5g; 0.4% 酚紅 10ml; 純水加入定容至1000ml。
4. 根據權利要求1所述的一種人肺炎支原體培養基，其特征在于，所述的禽蛋黃提 取物中含有維生素 A及有機硒，所述的維生素 A含量為2~10u/ml，所述的有機硒含量為 0· 2 ~2. Oppm。
5. 根據權利要求4所述的一種人肺炎支原體培養基，其特征在于，所述的禽蛋黃提取 物還含有微量的不飽和脂肪酸類與磷脂類物質，以及l〇-25v/ v%的乙醇。
6. 根據權利要求1~5中任一所述的一種人肺炎支原體培養基，其特征在于，所述的禽 蛋黃提取物制備方法如下： (1) 取新鮮富硒雞蛋置入70v/v%乙醇溶液中浸泡30分鐘； (2) 在超凈工作臺上無菌操作取蛋黃，將蛋黃置于無菌燒瓶中； (3) 向含有蛋黃的無菌燒瓶中以1 :2重量比例，加入90v/v%乙醇，充分攪拌、混勻，封 閉瓶口后置于4°C~8°C下，保存20-24h ; (4) 用IN NaoH調節步驟（3)處理后溶液的pH至7. 0~8. 0,并6000RPM離心，取上清 液，將上清液以0. 45 μ m濾膜無菌過濾后，濾液即為禽蛋黃提取物，將濾液無菌分裝后，備 用。
7. 根據權利要求1所述的一種人肺炎支原體培養基，其特征在于，所述的人肺炎支原 體培養基通過稀酸稀堿調節酸堿度，使培養基滅菌后pH為7. 4-7. 6。
8. -種包括權利要求1所述的人肺炎支原體培養基的診斷試劑盒。
【專利摘要】本發明涉及一種人肺炎支原體培養基及其診斷試劑盒，人肺炎支原體培養基包括TSB培養基與添加劑，所述的添加劑包括牛血清、DMEM、禽蛋黃提取物、丙酮酸鈉以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量為人肺炎支原體培養基總含量的5-15％(體積分數)，以人肺炎支原體培養基總體積計，所述的禽蛋黃提取物含量為10-100ml/L，所述的丙酮酸鈉含量為0.2-1.0g/L，所述的谷氨酰胺含量為0.3-1.0g/L。與現有技術相比，本發明的培養基在大量實踐基礎上進行實用創新設計，符合需要，確保臨床Mp感染診斷的特異性、可靠性，同時體現使用方便、快速安全、環保及資源節約的要求。
【IPC分類】C12Q1-04, C12R1-35, C12N1-20
【公開號】CN104673718
【申請號】CN201510075107
【發明人】文鳳岐, 武濟民, 孫亞洲, 肖家祁
【申請人】眾愛生河北生物科技有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月12日