立克次體甄別檢測基因芯片的制備和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及立克次體甄別檢測基因芯片的制備和用途，屬于基因芯片檢測技術領 域。
【背景技術】
[0002] 立克次體（rickettsiae)是一類除極少數外專性細胞內寄生的革蘭氏陰性菌，其 引起的立克次體病是一類重要的人畜共患的自然疫源性疾病，在世界范圍內呈散發性和季 節性流行。許多節肢動物如虱、蚤、蜱、螨等均可作為立克次體感染的傳播媒介。隨著國際 旅游業的發展，立克次體病被認為是威脅旅游健康的重要傳染病之一。近些年來，斑點熱新 種的不斷出現，埃立克體等新發立克次體的流行，都在提醒我們立克次體病大規模流行和 突然暴發的可能性。此外立克次體作為潛在的生物恐怖病原體，也日益受到重視，美國反對 生物恐怖主義（Bioterrorism)已將流行性斑疹傷寒、落基山斑點熱以及Q熱列在生物戰劑 名錄中。因此，加強立克次體的監測與防治具有重要的現實意義。
[0003]目前世界范圍內已發現具有致病性的立克次體有20余種，病人分離出的病原體 以及基因檢測證據表明我國至少存在10種立克次體病。立克次體病早期癥狀多樣，無特異 性臨床特征，臨床誤診率極高。延誤治療可引起嚴重的并發癥，甚至死亡。但是若能在感染 早期做出正確的診斷，低廉、有效的強力霉素及四環素即可對立克次體有效。因此快速、準 確的早期診斷是控制立克次體病的關鍵。傳統的立克次體檢測方法主要有分離培養、PCR 和免疫學診斷。但分離培養耗時長，操作復雜；PCR和免疫學方法只能檢測一種或幾種病原 體，不能完全滿足檢測種類多樣的立克次體的需要。而基因芯片技術具有快速、準確、低成 本等特點特別適用于立克次體病的高通量檢測。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于針對立克次體核酸高通量檢測領域存在的一些不足，研制一種 高通量、特異、敏感、快速的立克次體甄別檢測基因芯片，能同時檢測七種重要的立克次體， 包括普氏立克次體、莫氏立克次體、斑點熱群立克次體、貝氏柯克斯體、恙蟲病東方體、查菲 埃立克體、嗜吞噬細胞無形體，為立克次體感染的臨床診斷及流行病學調查提供一種新的 檢測手段。
[0005] 為了達到上述目的，本發明立克次體甄別檢測基因芯片，其制備方法如下：
[0006] 1.步驟一：制備立克次體屬通用及特異性引物
[0007] 選擇立克次體屬的ompB基因、貝氏柯克斯體icd基因、恙蟲病東方體47-KDa基 因、嗜吞噬細胞無形體ankA基因、查菲埃立克體trp-120基因等作為檢測靶基因，可以實現 7種立克次體靶基因片段的擴增。優選6對引物序列及其對應的擴增靶標，如表1所示：
[0008] 表1引物序列及對應的擴增靶標
[0009]
【主權項】
1. 一種甄別檢測七種立克次體的基因芯片，本發明的基因芯片可以用于同時甄別普 氏立克次體、莫氏立克次體、斑點熱群立克次體、貝氏柯克斯體、恙蟲病東方體、查菲埃立克 體、嗜吞噬細胞無形體。其特征是包含檢測立克次體的12條通用及特異性引物；8條立克 次體特異性寡核苷酸探針；1條立克次體屬通用探針；1條片基質控探針和1條陰性對照探 針和載體。上述探針分別分布在載體上。 表1立克次體屬通用擴增引物
表2貝氏柯克斯體擴增引物
表3恙蟲病東方體擴增引物
表4嗜吞噬細胞無形體擴增引物
表5查菲埃立克體擴增引物
表6立克次體特異性寡核苷酸探針序列
2. 根據權利1所述的立克次體甄別檢測基因芯片，其特征是所述的載體為醛基化修飾 的玻璃片、硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。
3. -種立克次體甄別檢測基因芯片的制備方法，包括以下步驟： 步驟一，探針和引物的設計：首先從NCBI基因數據庫中下載立克次體基因序列，序列 下載完成后，使用Vector NTI Advance lO(invitrogen)軟件包中的AlignX程序按照默認 的參數設置對各病原體基因序列進行全局比對。根據比對結果在基因序列的保守位置設計 特異性寡核苷酸探針、特異性引物。 步驟二，探針的合成，每條探針的3'端加入12個堿基T且3'末端T氨基修飾作為連 接臂，以使其能固定在醛基化修飾玻璃基片上；質控探針除3'末端T進行氨基修飾外，5'端 同時標記生物素標記； 步驟三，芯片的制備：將合成后的探針用去離子水稀釋成100 μ M，分別取10 μ L探針溶 液，和10 μ L體積芯片點樣液混勻，使探針點樣終濃度為50 μ Μ，裝于384孔板，將芯片表面 貼上10樣品孔陣列膜，用Pixsys 5000芯片制備儀（Cartesian Technologies)，采用接觸 式點樣方式，將探針點制在載體上，點樣過程中保持一定濕度，點樣完成后將芯片置于干燥 器中避光常溫靜置48h，使探針和芯片表面醛基脫去1分子水后共價結合，點制好的芯片常 溫干燥保存。
4. 根據權利要求3所述的立克次體甄別檢測基因芯片的制備方法，其特征是步驟一中 10條特異性寡核苷酸探針及12條引物，探針長度在20-37nt，引物長度在18-25nt。
5. 根據權利要求3所述的立克次體甄別檢測基因芯片的制備方法，其特征是步驟三種 所述的載體為醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。
6. 立克次體甄別檢測基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步驟： 1) 步驟一，立克次體基因組DNA的提取，使用市售商品化細菌基因組DNA提取試劑盒提 取立克次體基因組DNA ; 2) 步驟二，多重不對稱PCR擴增：擴增使用TaKaRa公司的PCR試劑，將整個擴增體系 分為A、B兩管。A管包括莫氏立克次體、普氏立克次體、斑點熱群立克次體、查菲埃立克體； B管包括貝氏柯克斯體、恙蟲病東方體、嗜吞噬細胞無形體。擴增按以下循環參數進行擴增： 95°〇預變性2!1^11;951：2〇8,551：2〇8,721：，2〇8，共45個循環 ；721：延伸51^11;41：保存或 進行下一步實驗； 3) 步驟三，芯片雜交：將基因芯片分別置0.2% SDS和去離子水中分別清洗30s，離心 干燥；將步驟二得到的擴增產物在95°C變性5min后立即置于冰浴中5min，取變性的A管產 物2. 5 μ L和B管產物2. 5 μ L與5 μ L雜交液混勻，使用加樣器加于芯片加樣孔使其均勻覆 蓋于陣列表面，將基因芯片放入雜交盒內在45°C雜交Ih ; 4) 步驟四，雜交后清洗基因芯片：基因芯片雜交完成后，從雜交盒中取出芯片，并立即 依次在洗液1\350+0.2%505、0.2父55(：和0.1\55(：中各清洗305，最后將基因芯片表面 液體離心干燥； 5) 步驟五，樣品標記：向芯片加入15 μ 1標記液，用移液器涂勾后將芯片放回雜受盒中 置37°C水浴中反應30min，取出芯片以PBST清洗10s，離心干燥； 6) 步驟六，掃描：向芯片反應區加入剛剛I : 1混合的發光液A和B的混合溶液，用移 液器涂勻后立即置化學發光成像儀中掃描，成像模式為觸發模式，曝光參數511，增益參數 300,曝光時間10s，觸發次數1次； 7) 步驟六，數據分析：成像結束后使用化學發光分析軟件進行芯片探針信號分析。每 條探針的信號取其三個重復點的平均值，根據探針Cutoff值，探針信號值>該探針Cutoff 值的判讀為該探針信號陽性。本發明使用方法的步驟二中PCR使用的反向引物修飾分子為 生物素。本發明使用方法步驟三中使用的雜交液組分為8XSSC，0. 6% SDS，10%甲酰胺， 10XDenhardt。
7. 根據權利要求6所述的立克次體甄別檢測基因芯片的使用方法，其特征是步驟二中 使用的用于擴增立克次體各特異性基因的反向引物5'端進行修飾。
8. 根據權利要求7所述的反向引物5'端修飾分子可以是CY3、CY5、生物素。
9. 根據權利要求6所述的立克次體甄別檢測基因芯片的使用方法，其特征是步驟三中 使用的雜交液組分為8 X SSC，0. 6 % SDS，10 %甲酰胺，10 X Denhardt。
10. 根據權利要求6所述的立克次體甄別檢測基因芯片的使用方法，其特征是步驟六 中使用的掃描方法，根據權利要求8中反向引物修飾分子的不同，掃描方法包括突光掃描， 可視化掃描，化學發光成像。
【專利摘要】本發明涉及一種立克次體甄別檢測基因芯片的制備和用途，其制備方法包括制備通用及特異性引物，制備七種立克次體核酸分型探針，制備寡核苷酸芯片，建立多重PCR體系，建立雜交體系。利用本發明制備的基因芯片可同時甄別七種重要的立克次體，包括普氏立克次體、莫氏立克次體、斑點熱群立克次體、貝氏柯克斯體、恙蟲病東方體、查菲埃里克體、嗜吞噬細胞無形體。該基因芯片具有快速、準確、高通量、特異性高的優勢，可為立克次體感染的臨床診斷及流行病學調查提供一種新的檢測手段。
【IPC分類】C12Q1-04, C12R1-01, C40B50-06, C12Q1-68, C40B40-06
【公開號】CN104651498
【申請號】CN201510033678
【發明人】王升啟, 李靈云, 劉琪琦, 陳蘇紅, 張敏麗, 張英杰
【申請人】中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年1月23日