水稻OsSTAP1基因在增強植物耐鹽性中應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域中水稻AP2/EREBP轉錄因子家族基因OsSTAPI在增強植 物耐鹽性中應用。
【背景技術】
[0002] 各種生物和非生物脅迫是影響水稻生長和產量的重要因素，發掘能夠改善水稻抵 抗逆境脅迫能力的基因將為基因工程改良水稻新品種打下基礎。在長期進化過程中，植物 在分子、細胞、生理和生物化學水平上發展出多種機制應對逆境脅迫，轉錄因子作為上游調 控基因在植物的脅迫應答途徑中扮演重要的角色。植物中參與脅迫應答反應的主要有AP2/ EREBP、bZIP、NAC、MYB和WRKY轉錄因子家族。其中AP2/EREBP轉錄因子家族基因廣泛參與 植物的發育、激素信號轉導、病原反應與干旱、高鹽及低溫等脅迫應答反應。該家族轉錄因 子的共同特點是含有一個60個氨基酸左右的AP2結構域，它在與DNA結合中具有重要的作 用。根據AP2結構域的特點，AP2/EREBP轉錄因子家族被分為：AP2、EREBP、RAV和其它共4 個亞類。AP2成員含有2個重復的AP2結構域，而RAV成員含一個AP2結構域和一個類似 B3結構域；EREBP亞家族成員含有一個AP2結構域，且有ERF和DREB/CBF兩個分支。
[0003] 研宄表明，EREBPs轉錄因子廣泛參與植物的生物和非生物脅迫應答反應。 ERFs類轉錄因子主要參與植物的生物脅迫應答反應，如病原反應、傷害反應、乙烯信 號途徑。最早發現的ERF轉錄因子是從煙草中分離得到的4個乙烯誘導病程相關 (pathegenesis-related，PR)蛋白EREBP1-4,它們通過結合下游基因啟動子區域的乙稀應 答元件GCCbox調控下游基因的表達。GCCbox廣泛存在于煙草和其他植物PR蛋白基因的 5'UTR區域，核心序列是AGCCGCC。1997年，Zhou等在番茄中發現3個ERF蛋白（Pti-4、 Pti-5和Pti-6)能夠和疾病防御蛋白Pto相互作用，進一步驗證了ERFs轉錄因子在植物的 病原反應中具有重要作用。在植物中超表達一些ERFs基因亦能夠提高植物的抗病能力，如 ERFl、Pti4、ATERFl基因。最近的研宄表明水稻中的ERF轉錄因子在乙烯應答、淹水脅迫應 答、干旱脅迫應答等多種生物途徑中起著正向調節作用。
[0004]DREBs轉錄因子在植物的冷、干旱、高鹽、過氧化物等脅迫應答途徑中具有重要 的作用，參與不依賴于ABA的脅迫應答反應。DREBs轉錄因子通過結合下游基因啟動子 區的干旱應答順式作用元件DRE/CRT而調控下游基因的表達。干旱應答順式作用元件 DRE(dehydration-responsiveelement)最早在逆境脅迫誘導基因rd29A的啟動子區域被 發現，核心序列為A/GCCGAC。與DRE相似的順式作用元件CRT(C-repeat)則是在一個冷誘 導基因C〇rl5a的啟動子區被發現，其核心序列是TGGCCGA。DRE/CRT被發現存在于多個受 干旱和低溫誘導的基因的啟動子區域。在擬南芥、水稻等植物中超表達DREB家族的基因 大多能提高植株應對非生物脅迫的能力。迄今為止，越來越多的DREBs基因從不同植物中 被克隆。在水稻中發現的DREB基因有OsDREBlA-G，0sDREB2A、0sDREB2B，其中OsDREBlA、 OsDREBlE、OsDREBIG、0sDREB2A、0sDREB2B能夠特異性地結合DRE。研宄發現在擬南芥中超 表達OsDREBlA能夠提高擬南芥植株耐受低溫、高鹽和干旱的能力（DubouzetJG，Sakuma Y，ItoY，KasugaM，DubouzetEG，MiuraS，SekiM，ShinozakiK，Yamaguchi-Shinozaki K.OsDREBgenesinrice，OryzasativaL，encodetranscriptionactivatorsthat functionindrought-，high-salt-andcold-responsivegeneexpression.PlantJ， 2003, 33 :751-763);在水稻中超表達OsDREBIG和0sDREB2B也能夠明顯地提高轉基因水稻 的抗旱性，而超表達OsDREBlE僅僅能夠輕微地提高水稻抵抗干旱的能力（ChenJQ，Meng XP，ZhangY，XiaM，WangXP.Over-expressionofOsDREBgenesleadtoenhanced droughttoleranceinrice.BiotechnolLett,2008,30(12) ：2191-2198)〇 [0005]ERFs和DREBs轉錄因子功能的差異主要體現在它們能夠結合的順式作用元 件和調節的下游基因不同。有些EREBPs轉錄因子既能結合DRE，也能結合GCCbox，如 TINY、TINY2、BnDREBIII、AtERFl、AtERF4、AtEBP和CBF1 ;而部分只能結合DRE，如CBF2/ DREB1C和CBF3/DREB1A等。ERFs轉錄因子傾向于結合GCCbox，DREBs轉錄因子則傾 向于結合DRE。為了發掘影響兩類轉錄因子結合的關鍵氨基酸，Sakuma等（SakumaY， LiuQ，JosephG.DNA-bindingspecificityoftheERF/AP2domainofArabidopsis DREB，transcriptionfactorsinvolvedindehydration-andcold-induciblegene expression.BiochemBiophyResCommun，2002, 290:998-1009)通過多序列比對分析發現 擬南芥中的DREBs轉錄因子的AP2結構域第15和第20個氨基酸分別是纈氨酸（Val，V) 和谷氨酸（Glu，E)，而ERFs轉錄因子的AP2結構域第15和20個氨基酸是丙氨酸（Ala，A) 和天冬氨酸（Asp，D)，進一步研宄表明Val-15和Glu-20特別是Val-15對于結合DRE有重 要的作用，但不影響對GCCbox的結合，這可能是造成ERFs和DREBs轉錄因子功能不同的 原因。為了發掘影響GCCbox結合的關鍵氨基酸，孫山等（SunS，YuJP，ChenF，ZhaoT J，FangXH，LiYQ，SuiSF.TINY,adehydration-responsiveelement(DRE)-binding protein-liketranscriptionfactorconnectingtheDRE-andethylene-responsive element-mediatedsignalingpathwaysinArabidopsis.BiolChem，2006,283 : 6261-6271)比較能夠結合兩種順式作用元件的蛋白序列和只能結合DRE的蛋白序列發現 兩類蛋白的AP2保守區的第16個氨基酸不同，進一步研宄表明Ser-16對于擬南芥中的 DREB轉錄因子TINY結合GCCbox是必不可少的。TINY既參與生物脅迫反應途徑，也參與 非生物脅迫途徑，說明DRE介導的調控途徑和GCCbox介導的調控途徑存在一定的重疊。
[0006] 水稻中有些AP2/EREBP轉錄因子基因在受到非生物脅迫時表達量明顯升高，其中 大部分基因為DREBs和ERFs，這些基因很有可能與水稻的非生物脅迫應答反應相關。雖然 近年來對于EREBPs轉錄因子參與非生物脅迫應答反應的機制有了較全面的研宄，但是水 稻中還有很多的EREBPs基因的功能未知。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供序列表中序列1所示的蛋白及其編碼基因（OsSTAPl)。
[0008] 本發明提供了序列表中序列1所示的蛋白及其編碼基因在增強植物耐鹽性中的 應用；所述蛋白的編碼基因為如下1)-4)中任一所述的基因；
[0009] 1)序列表中序列2、3的自Y末端第93位-1097位所示的DNA分子；
[0010] 2)序列表中序列2、3所示的DNA和RNA分子；
[0011] 3)在嚴格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
[0012] 4)與1)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分 子。
[0013] 含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達載體在增強植物耐鹽性中 的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0014] 所述植物為單子葉植物-水稻，包括雙子葉植物。
[0015] 本發明所提供的培育轉基因植物的方法，是將序列表中序列1所示的蛋白的編碼 基因導入植物中，得到轉基因植物；所述轉基因植物與目的植物相比耐鹽性增強。
[0016] 本發明通過PEG、高鹽、低溫脅迫以及ACC誘導下OsSTAPl基因在日本晴中的差異 表達，結合超表達水稻植株的耐鹽表型變化，開展其基因克隆與功能分析，分析候選基因與 水稻非生物脅迫應答的關系。結果表明，OsSTAPl基因在受到高鹽、PEG脅迫及ACC誘導時 表達量迅速增加；在水稻中超表達OsSTAPl基因能夠顯著改善水稻抵御鹽脅迫的能力。本 發明為改良、增強水稻耐鹽性，加速抗逆分子育種進程，具有十分重要的理論和實際意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1為以實時定量PCR分析OsSTAPl在非生物脅迫下0-48小時的表達量差異
[0018] 圖2為以實時定量PCR分析OsSTAPl在超表達株系中的表達量
[0019] 圖3為Southernblot方法檢測超表達株系中的目的基因
[0020] 圖4為超表達OsSTAPl的轉基因植株耐鹽相關表型鑒定，A:對照條件；B:鹽脅迫 處理；C:處理后恢復
【具體實施方式】
[0021] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0022] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0023] 實施例1、不同脅迫處理條件下OsSTAPl基因在水稻日本晴中的表達差異
[0024] 日本晴（Nipponbare，Oryzasativassp.japonica)(公眾可從中國農業科學院作 物科學研宄所獲得，記載過該材料的非專利文獻是：YongqingJiao，YonghongWang，Dawei Xue，JingWang，MeixianYan，GuifuLiu，GuojunDong，DaliZeng，ZefuLu，XudongZhu， QianQianandJiayangLi(2010)Regulationof0sSPL14by0smiR156definesideal plantarchitectureinrice.NatureGenetics，42,541-544)〇
[0025] 1、水稻的低溫、高鹽、PEG脅迫及ACC誘導
[0026] 水稻日本晴種子經消毒處理，室溫浸種2d，37°C催芽ld，萌發后選發芽一致的種 子播于塑料盒泡沫架上，每孔2粒，二葉前水培，二葉后用Yoshida營養液培養。于五葉期 開始低溫（4°C)、高鹽（150mmolLlaCl)、滲透脅迫（20%PEG)、ACC(100mmolI71)誘導處 理，日本晴于脅迫處理0h、lh、3h、6h、12h、24h、48h后取葉