一種與結直腸癌相關的血漿miRNA生物標志物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術和腫瘤學領域，設及一種與結直腸癌相關的血漿miRNA生物 標志物及其應用。
【背景技術】
[0002] 結直腸癌（Colorectal cancer, CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在世界全 腫瘤中發病率排名第=。在歐美等國，結直腸癌在全腫瘤的發病率和死亡率分別約占8. 6% 和8. 8%。從全世界范圍看，雖然中國是結直腸癌低發區，但是結直腸癌發病率呈逐年上升 趨勢。早期結直腸癌缺少特異癥狀，當患者因臨床癥狀明顯而就診時往往已處于中晚期，大 約25%的患者首診時就已出現轉移，嚴重影響治療效果和預后。結直腸癌的高發不僅給患 者帶來嚴重的健康損害，而且也給家庭、社會帶來嚴重的精神和經濟負擔。結直腸癌患者在 疾病發展早期階段確診時被治愈的可能性很高；而且，對高危人群進行早期篩查可W有效 地降低結直腸癌發病率和死亡率。因此，對結直腸癌的早期確診是降低其死亡率、提高生存 率的關鍵因素。
[0003] 結直腸癌的診斷一般采用結腸鏡、雙重對比領灌腸W及CT成像等技術，但是該些 方法在用于大人群的結直腸癌早期診斷上存在一定的缺陷：內鏡檢測不當或人為經驗不足 等會導致誤診或漏診，而且內鏡檢測過程的不適感更加限制其廣泛應用；影像學檢查對早 期結直腸癌的診斷具有一定的局限性。目前，方便簡單的檢測方法（如大便隱血試驗F0BT 等）和一些腫瘤標志物檢測（如癌胚抗原CEA等）已用于結直腸癌的早期診斷，由于其檢測 結果的低靈敏度和低特異性，該些方法不適合用于大人群的結直腸癌篩查。因此，我們迫切 需要尋找新型的高靈敏度、高特異性的結直腸癌分子生物標志物用于結直腸癌早期診斷。
[0004] 近年來，大量研究報道微小RNAs (microRNAs，miRNAs)參與了機體內包括發育、細 胞增殖、分化和調亡等多種重要的生物學過程；而且，miRNAs可發揮癌基因或抑癌基因樣 作用在人類多種惡性腫瘤如結直腸癌、肺癌、胃癌等的發生發展過程中扮演著重要的角色， 其表達失調可能是參與腫瘤發病的重要機制。研究發現，miRNAs在組織中的表達模型呈現 出較為顯著的腫瘤相關性、組織特異性和表達穩定性，因而能更精確地進行腫瘤類型分類、 判斷腫瘤預后W及跟蹤病程進展。一些研究者通過比較結直腸癌組織及其相鄰的正常組織 間的miRNAs的表達差異，來鑒定可用于診斷結直腸癌的miRNAs生物標志物。然而，大多 結直腸癌患者就診時已屬中晚期，而且組織樣本取材具有創傷性，在臨床上無法實現組織 miRNAs用于結直腸癌的早期診斷。
[0005] 進一步研究發現，miRNAs在外周血（包括血清、血漿）中可長期穩定存在，RNA 酶降解、反復凍融、酸堿環境、煮沸、長期保存等各種處理方法均不會對循環miRNAs造成 損失；而且，循環miRNAs表達也被證實具有較好的腫瘤相關性和組織特異性。鑒于循環 miRNAs檢測具有無創、高靈敏度、高特異性、重復性好等優點，將循環miRNAs用于腫瘤早 期檢測和判斷預后生物標志物具有良好的臨床應用前景。
[0006] 綜述目前已有的研究報道，雖然發現多個循環miRNAs適用于結直腸癌早期診斷， 但其與組織內表達趨勢是否一致存在爭議，且診斷價值單一，不同miRNAs缺乏診斷一致 性，亦或同一 miRNAs存在診斷差異性，因此需要綜合評價循環miRNAs對于結直腸癌早期診 斷價值的應用。
【發明內容】
[0007] 解決的技術問題：本發明的目的在于針對目前所有與結直腸癌相關的、且具有潛 在早期診斷價值的循環miRNAs,提供一種與結直腸癌相關的血漿miRNA生物標志物及其 應用，綜合評價其對于結直腸癌早期診斷的應用價值，為臨床上結直腸癌早期發現、早期診 斷、早期治療提供支持。
[000引技術方案：
[0009] 一種與結直腸癌相關的miRNA生物標志物，所述生物標志物為：血漿miR-21。
[0010] miRNA生物標志物血漿miR-21在制備篩查診斷結直腸癌試劑盒中的應用。
[0011] 一種篩查診斷結直腸癌試劑盒，含有miRNA生物標志物血漿miR-21。
[0012] 血漿miR-21在篩查診斷結直腸癌中的應用。
[0013] 含有miRNA生物標志物血漿miR-21的試劑盒在篩查診斷結直腸癌中的應用。
[0014] 具體篩查方案為：
[0015] (1)匯總所有與結直腸癌相關、且具有潛在早期診斷價值的循環miRNAs ;
[0016] (2)對匯總的循環miRNAs進行診斷性meta分析，綜合評估其作為結直腸癌早期診 斷生物標志物的價值；
[0017] (3)采用"TagMan probe-based qRT-PCR方法，對候選miRNAs進行人群血漿樣本驗 證，建立結直腸癌血漿miRNAs表達模型；并采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve, ROC)分析評價候選miRNAs對結直腸癌的診斷價值；
[0018] (4)組織生物樣本檢驗候選miRNAs在結直腸癌組織和血漿中的表達一致性。
[0019] 有益效果：目前研究認為，血漿miRNAs的主要來源于腫瘤組織分泌的或者是腫瘤 細胞死亡游離所致，但是，組織內差異表達的miRNAs在血漿中并不一定就差異表達，有的 miRNAs甚至相反。雖然在結直腸癌組織中已經確定miR-21可作為標志物，但是在外周血漿 樣本的報道中結果不一致，本發明的創新在于確定了血漿miR-21與組織miR-21表達趨勢 一致性，血漿miR-21可作為診斷標志物，而且是無創的，可W用于未來的臨床。本發明首次 將所有已知、具有潛在結直腸癌早期診斷價值的循環miRNAs進行綜合性meta分析評估，W 判斷其真實診斷價值；并在血漿和組織生物樣本中，進一步驗證其表達差異和診斷價值，W 達到最優評價體系，W此篩選出的循環miRNAs生物指標更具有臨床指導性，為今后開發早 期診斷結直腸癌非侵入性生物標志物提供理論依據，具有重大的臨床實用價值。
【附圖說明】
[0020] 圖1.層次綜合受試者工作特征曲線模型評價循環miR-21對結直腸癌的診斷價值 示意圖；
[0021] 圖2.獨立驗證人群中血漿miR-21對于結直腸癌診斷價值評價。圖中a為血漿 miR-21在結直腸癌患者和健康對照人群的表達差異；b為受試者工作特征曲線評價血漿 miR-21甄別結直腸癌患者和健康對照人群的能力圖示；C為風險評分系統評估血漿miR-21 對罹患結直腸癌的風險。
[0022] 圖3.miR-21在結直腸癌組織中的表達模式圖。圖中a為miR-21在GSE28364表 達譜數據庫中表達，組織為配對的癌及其癌旁正常組織；b為miR-21在GSE35602表達譜數 據庫中表達，組織為非配對的癌和正常腸組織；C為miR-21在TCGA數據庫中表達，組織為 配對的癌及其癌旁正常組織。
【具體實施方式】
[0023] W下通過實施例對本發明作進一步的闡述。本實施例在W本發明技術方案為前提 下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的包含范圍不限于下述的實施例。下 面的實施例中未注明的條件和方法等均按照常規或者制造廠商所建議的條件進行。
[0024] 1、匯總所有與結直腸癌相關、且具有潛在早期診斷價值的循環miRNAs
[0025] 截至2013年11月，在已有的開放數據庫化bMed中檢索與結直腸癌相關、并設及 到循環miRNAs的所有已發表文獻，主題詞或關鍵詞如下；"circulating"或"serum"或 "plasma", "miRNA"或"microRNA"或"miR"，"colorectal"或"colon"或"rectal"，W及 "cancer"或"carcinoma"或"neoplasm",并結合手工檢索方式參考會議紀要或引用文獻獲 得符合納入標準的文獻。文獻的納入標準包括；①患者為經組織病理學確診的結直腸癌患 者；②用于檢測miRNAs的外周血（包括血漿、血清）在進行臨床治療前采集；⑨納入檢測 循環miRNAs并探討其與結直腸癌診斷相關性的研究；④所納入的研究必須提供足W進行 2X2表分析的數據；⑥對照組為良性疾病人群或健康個體。排除標準包括；①綜述或致編 者函；②重復論文中排除較小樣本量或較早發表的文獻；⑨排除非英文撰寫論文。該部分 由雙人獨立完成，待雙人仔細校正后無爭議文獻納入后續分析。所有納入文獻經診斷價值 評估體系（The Quality Assessment of Diagnostic Ac州racy Studies, QUADA巧進行評 分。
[0026] 參照W上文獻納入標準和排除標準，共有11篇文獻滿足要求。其中有4篇文獻報 道的miRNAs為一組miRNAs,或僅獨立miRNA，無法進行后續的診斷性meta分析。另外，考 慮到部分文獻包含兩個獨立性研究，因此，最終納入診斷性meta分析的文獻共7篇，包括6 項關于miR-21的研究和4項關于miR-92a的研究，見表1。
[0027]
【主權項】
1. 一種與結直腸癌篩查診斷相關的miRNA生物標志物，其特征在于，所述生物標志物 為：血漿miR-21。 2. miRNA生物標志物血漿miR-21在制備篩查診斷結直腸癌試劑盒中的應用。
3. -種篩查診斷結直腸癌試劑盒，其特征在于含有miRNA生物標志物血漿miR-21。
4. 血漿miR-21在篩查診斷結直腸癌中的應用。
5. 含有miRNA生物標志物血漿miR-21的試劑盒在篩查診斷結直腸癌中的應用。
【專利摘要】一種與結直腸癌診斷相關的血漿miRNA生物標志物及其應用，屬于生物技術和腫瘤學領域。與結直腸癌診斷相關的血漿miRNA生物標志物為血漿miR-21。目前研究認為，血漿miRNAs的主要來源于腫瘤組織分泌的或者是腫瘤細胞死亡游離所致，但是，組織內差異表達的miRNAs在血漿中并不一定就差異表達，有的miRNAs甚至相反。雖然在結直腸癌組織中已經確定miR-21可作為標志物，但是在外周血漿樣本的報道中結果不一致，本發明的創新在于確定了血漿miR-21與組織miR-21表達趨勢一致性，血漿miR-21可作為診斷標志物，而且是無創的，可以用于未來的臨床。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104630357
【申請號】CN201510047326
【發明人】王美林, 張正東, 杜牧龍, 朱陵君, 顧冬英, 石丹妮, 陳錦飛, 儲海燕, 仝娜
【申請人】南京醫科大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月29日