一種檢測線粒體dna鑒定辣椒細胞質雄性不育系的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測線粒體DNA鑒定辣椒細胞質雄性不育系的方法，屬于細胞質雄性不育檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]植物界中細胞質雄性不育非常常見，利用雄性不育進行育種是國際制種業的主要趨勢，該技術可免去人工去雄，提高雜交種子的純度和擴大遺傳距離而增加產量；細胞質雄性不育主要與線粒體DNA重排相關，至今沒有兩個細胞質雄性不育突變被發現是完全相同。水稻、玉米和小麥等植物已經建立了細胞質雄性不育系和可育之間的細胞質分子標記，能很快的區分不育系和可育材料；而對辣椒雄性不育系遺傳物質的研宄主要集中在細胞核方面，細胞質方面很少見報道，能直接用于鑒定辣椒細胞質雄性不育系的細胞質分子標記更少，因而無法簡單快速的區分細胞質雄性不育系，這限制了辣椒雜交育種的發展。
【發明內容】
[0003](一 )要解決的技術問題
[0004]為解決上述問題，本發明提出了一種檢測線粒體DNA鑒定辣椒細胞質雄性不育系的方法，通過檢測線粒體DNA確定辣椒細胞質雄性不育系的特征位點，進行細胞質雄性不育系鑒定；其檢測過程比較簡單，檢測結果準確。
[0005]( 二)技術方案
[0006]本發明的檢測線粒體DNA鑒定辣椒細胞質雄性不育系的方法；所述方法包括以下步驟:
[0007]第一步，提取總DNA，采取CTAB法提取待測辣椒葉片中的總DNA ；
[0008]第二步，用線粒體引物Ml和M2對上述的總DNA進行PCR擴增；
[0009]第三步，對所得PCR擴增產物進行克隆測序；
[0010]第四步，將所得堿基序列與可育辣椒序列對比，對比辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA分子指紋，確定辣椒細胞質雄性不育系的特征位點，進行細胞質雄性不育系鑒定。
[0011]進一步地，所述線粒體引物Ml的正向序列為:
[0012]5-TGGATTACCTCTTCCAACT-3，
[0013]所述線粒體引物Ml的反向序列為:
[0014]5-ATCACTATATGGAACCAAC-3 ；
[0015]所述線粒體引物M2的正向序列為:
[0016]5-CGATCTTAGTTGGAGGAG-3，
[0017]所述線粒體引物M2的反向序列為:
[0018]5-CCAACGGAAACCTAGTTA-3。
[0019]進一步地，所述辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA分子指紋:
[0020]Ml片段:辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA在位點8、11、22_23、25、29、831、867和879分別為T、C、AT、Α、C、G、T和C，而可育辣椒在這些位點分別為C、A、CG、C、C、T、A和T ;
[0021]M2片段:辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA在位點11-12、15-18、22_26、34_35、38-42,47-58 和 63-56 為 GG、GATA, GATAC, GA、CTGGT, CTAGCTTTGCCG 和 GCC，而可育辣椒在這些位點分別為 TA、ATCG、ATAGA、TT、TAACC、GGTATCACTGGT 和 AGT。
[0022](三)有益效果
[0023]與現有技術相比，本發明檢測線粒體DNA鑒定辣椒細胞質不育系的方法，在鑒定辣椒細胞質不育系時只需對線粒體引物Ml和M2的PCR擴增產物進行克隆測序，然后進行比較即可簡單、高效和準確的鑒定出辣椒細胞質雄性不育系。
【附圖說明】
[0024]圖1是本發明實施例1的3個細胞質雄性不育系和相應的保持系供試材料表。
[0025]圖2是本發明實施例1的線粒體引物的列表。
[0026]圖3是本發明實施例1的線粒體信息位點列表。
【具體實施方式】
[0027]實施例1:
[0028]如圖1至圖3所示，本發明以3份常規辣椒品種為對照，對3個細胞質雄性不育系和相應的保持系進行線粒體Ml和M2片段的擴增序列，并運用相關軟件分析，建立辣椒細胞質雄性不育系的線粒體DNA分子指紋。
[0029]其具體步驟如下:
[0030]第一步，提取總DNA，采取CTAB法提取待測辣椒葉片中的總DNA ；
[0031]第二步，用線粒體引物Ml和M2對上述的總DNA進行PCR擴增；
[0032]第三步，對所得PCR擴增產物進行克隆測序；
[0033]第四步，將所得堿基序列與可育辣椒序列對比，對比辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA分子指紋，確定辣椒細胞質雄性不育系的特征位點，進行細胞質雄性不育系鑒定。
[0034]其中，所述線粒體引物Ml的正向序列為:
[0035]5-TGGATTACCTCTTCCAACT-3，
[0036]所述線粒體引物Ml的反向序列為:
[0037]5-ATCACTATATGGAACCAAC-3 ；
[0038]所述線粒體引物M2的正向序列為:
[0039]5-CGATCTTAGTTGGAGGAG-3,
[0040]所述線粒體引物M2的反向序列為:
[0041]5-CCAACGGAAACCTAGTTA-3。
[0042]上述辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA分子指紋中，
[0043]不育辣椒:在Ml 片段的位點 8、11、22-23、25、29、831、867 和 879 分別為 T、C、AT、A、C、G、T 和 C，在 M2 片段的位點 11-12、15-18、22-26、34-35、38-42、47-58 和 63-56 分別為GG、GATA、GATAC、GA、CTGGT、CTAGCTTTGCCG 和 GCC ；
[0044]可育辣椒:在Ml片段的位點8、11、22-23、25、29、831、867和879分別為為(:、4、〇6、C、C、T、A 和 T，在 M2 片段的位點 11-12、15-18、22-26、34-35、38-42、47-58 和 63-56 分別為TA、ATCG、ATAGA、TT、TAACC、GGTATCACTGGT 和 AGT。
[0045]其檢測結果為:9704A、PBC362A和Co4761A為細胞質雄性不育系。
[0046]上面所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的構思和范圍進行限定。在不脫離本發明設計構思的前提下，本領域普通人員對本發明的技術方案做出的各種變型和改進，均應落入到本發明的保護范圍，本發明請求保護的技術內容，已經全部記載在權利要求書中。
【主權項】
1.一種檢測線粒體DNA鑒定辣椒細胞質雄性不育系的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟: 第一步，提取總DNA，采取CTAB法提取待測辣椒葉片中的總DNA ； 第二步，用線粒體引物Ml和M2對上述的總DNA進行PCR擴增； 第三步，對所得PCR擴增產物進行克隆測序； 第四步，將所得堿基序列與可育辣椒序列對比，對比辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA分子指紋，確定辣椒細胞質雄性不育系的特征位點，進行細胞質雄性不育系鑒定。
2.根據權利要求1所述檢測線粒體DNA鑒定辣椒細胞質雄性不育系的方法，其特征在于: 所述線粒體引物Ml的正向序列為:5-TGGATTACCTCTTCCAACT-3， 所述線粒體引物Ml的反向序列為:5-ATCACTATATGGAACCAAC-3 ； 所述線粒體引物M2的正向序列為:5-CGATCTTAGTTGGAGGAG-3， 所述線粒體引物M2的反向序列為:5-CCAACGGAAACCTAGTTA-3。
3.根據權利要求1或2所述檢測線粒體DNA鑒定辣椒細胞質雄性不育系的方法，其特征在于，所述辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA分子指紋: Ml片段:辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA在位點8、11、22-23、25、29、831、867和879分別為T、C、AT、A、C、G、T和C，而可育辣椒在這些位點分別為C、A、CG、C、C、T、A和T ; M2片段:辣椒細胞質雄性不育線粒體DNA在位點11-12、15-18、22-26、34-35、38-42、47-58 和 63-56 為 GG、GATA, GATAC, GA、CTGGT, CTAGCTTTGCCG 和 GCC，而可育辣椒在這些位點分別為 TA、ATCG、ATAGA、TT、TAACC、GGTATCACTGGT 和 AGT。
【專利摘要】本發明公開了一種檢測線粒體DNA鑒定辣椒細胞質雄性不育系的方法，以辣椒葉片為材料，提取葉片中的總DNA，用線粒體引物M1和M2進行PCR擴增，對擴增產物進行克隆測序，再與辣椒細胞質雄性不育的線粒體DNA分子指紋進行比較即可簡單、高效和準確的鑒定出辣椒細胞質雄性不育系。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104630347
【申請號】CN201510006722
【發明人】歐立軍, 楊博智, 危革, 劉周斌, 鄒學校, 戴雄澤, 張竹青
【申請人】湖南省蔬菜研究所, 歐立軍
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月7日