一種快速檢測慢性粒細胞白血病bcr/abl融合基因及其剪切突變體的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及血液病分子生物學領域，尤其設及一種快速檢測慢性粒細胞白血病 BCR/A化融合基因及其剪接突變體的方法。
【背景技術】
[000引慢性粒細胞白血病是造血組織的惡性腫瘤，BCR/A化融合基因及其不同突變體的 檢測是該病診斷、病情監測、預后及指導治療的一個關鍵指標。目前的檢測方式很難同時檢 測該基因的不同突變體，大多只能檢測其中一個基因，且檢出率低，耗費時間較長。
[0003] 因此，現有技術有待于改進。
【發明內容】
[0004] 本發明為了解決現有技術的不足，提供一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL 融合基因的方法，采用多重巢式PCR方法，短時間內快速檢測出BCR/A化融合基因及其不同 突變體。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明實施例提供的一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ 融合基因的方法，采用如下技術方案：
[0006] 一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/A化融合基因的方法，其特征在于，包括如 下步驟：
[0007] (1) A液；特異性逆轉錄引物
[000引 引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀釋混勻，濃度為2. 5pmol/ y 1 ;
[0009] B液；巢式第一輪PCR反應液500 y 1 (20測試）；
[0010] 包含引物為；80?-1、80?-3、48心1、624-1、624-3;
[00川 第一輪多重PCR引物lOOpmol/條，緩沖體系為；Tris-肥L (P服.3) 8. 8MM、K化 44MM、dNTPs 0. 16MM/each、Mg化21.32MM。儲存于-20°C，備用；
[001引 C液；巢式第二輪PCR反應液500 y 1 (20測試）；
[0013] 包含引物為；80?-2、80?-4、48心2、624-2、624-4;
[0014] 各組第二輪多重PCR引物125pmol/條，反應緩沖體系為；Tris-肥L(PH 8. 3) 9. 6MM、K化 48MM、dNTPs 0. 192MM/each、Mg化2I. 44MM，儲存于-20°C，
[00巧]D液：陰性對照（陽性內對照）健康人外周血單個核細胞cDNA溶液，
[0016] E液：陽性對照-BCR/ABL b3a2陽性K562細胞系cDNA溶液，
[0017] F液：陽性對照-BCR/ABL ela2陽性患者cDNA溶液，
[001引 G液：陽性對照-BCR/ABL b2a2陽性患者cDNA溶液；
[0019] (2)采用廣泛表達的轉錄因子增強子結合因子基因（E2A)的mRNA作為陽性內對 昭. y >、、 》
[0020] 做巢式第一輪PCR(25 y 1體系）；各取患者cDNA、陰性對照D液和陽性對照E液 2^1，各取6液22111^39〇臟聚合酶0.5^1(1.25巧，口0?條件為；951：5111111后，951：變性 30s，58°C退火30s，72°C延伸lOmin，共30個循環，結束反應；
[002U (4)巢式第二輪PCR(25ul體系）；各取C液22yl，相應的第1輪PCR產物2yl， Taq DM聚合酶0. 5 y 1 (1. 25U)。PCR反應條件同第一輪。
[0022] 本發明提供的一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/A化融合基因的方法，采用特 異性的反轉錄引物，提高轉錄效率，采用多重巢式PCR方式增加PCR效果，較短時間內快速 檢測出BCR/A化融合基因及其不同突變體，為疾病的早期診斷及祀向治療提供依據。
【附圖說明】 圖1為BCR/A化融合基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳邸染色后紫外燈下成像結果。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合本發明實施例提供的快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/A化融合基因的 方法進行詳細描述。
[0024] 如圖1所示，本發明實施例提供的一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/A化融合 基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：
[002引 （1) A液；特異性逆轉錄引物
[0026] 引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀釋混勻，濃度為2. 5pmol/ y 1，
[0027] B液；巢式第一輪PCR反應液500 y 1 (20測試）；
[002引 包含引物為；BCR-1，BCR-3, ABkl，E2A-1，E2A-3，
[0029] 第一輪多重PCR引物lOOpmol/條，緩沖體系為；Tris-肥L(地8. 3)8. 8MM、K化 44MM、dNTPs 0. 16MM/each、Mg化21.32MM。儲存于-20°C，備用，
[0030] C液；巢式第二輪PCR反應液500 y 1 (20測試）；
[003U 包含引物為；BCR-2, BCR-4, ABk2, E2A-2, E2A-4，
[003引各組第二輪多重PCR引物125pmol/條，反應緩沖體系為；Tris-肥L(地 8. 3) 9. 6MM、K化 48mm、dNTPs 0. 192MM/each、Mg化21. 44MM，儲存于-20°C，
[003引 D液：陰性對照（陽性內對照）健康人外周血單個核細胞cDNA溶液，
[0034] E液：陽性對照-BCR/ABL b3a2陽性K562細胞系cDNA溶液，
[003引 F液：陽性對照-BCR/ABL ela2陽性患者cDNA溶液，
[0036] G液：陽性對照-BCR/ABL b2a2陽性患者cDNA溶液；
[0037] (2)采用廣泛表達的轉錄因子增強子結合因子基因（E2A)的mRNA作為陽性內對 照；
[00測 做巢式第一輪PCR(25 y 1體系）；各取患者cDNA、陰性對照D液和陽性對照E液 2yl，各取 B 液 22yl，Taq DNA 聚合酶 0. 5yl(1.25U)，PCR條件為；95°C 5min 后，95°C 變 性30s，58°C退火30s，72°C延伸lOmin，共30個循環，結束反應；
[0039] (4)巢式第二輪PCR(25y 1體系）；各取C液22y 1，相應的第1輪PCR產物2y 1， Taq DM聚合酶0. 5 y 1 (1. 25U)。PCR反應條件同第一輪。
[0040] 實施例；
[0041] 1.骨髓單個核細胞（MNC)分離；
[0042] (1)取5ml淋己細胞分離液加入干凈試管中，將5ml生理鹽水稀釋骨髓液或患者外 周血小屯、地加到分離液上，勿使界面混合，離屯、15(K)巧mX 20分鐘（min),輕輕吸出中間層 的單個核細胞（MNC)。
[004引 （2)加入10ml生理鹽水，混勻，離屯、12(K)巧mXlOmin，棄去上清。
[0044] (3)吸盡殘留液體，置-70°C保存或直接進行下一步操作。
[0045] 2. RNA 的提取
[0046] (1)從-7〇°C冰箱取出MNC，立即加入Trizol試劑1ml，反復吹打混勻，置室溫5分 鐘，使細胞溶解。
[0047] 似加S氯甲燒0. 2ml，劇烈振搖30秒鐘，置室溫3分鐘，離屯、12000巧mX 15min
[0048] (3)仔細吸取上層水相，轉移至另一 EP管中，加入0. 5ml異丙醇，顛倒混勻3~4 次，置室溫10分鐘。離屯、120(K)巧mX lOmin，可見針尖大小沉淀即總RNA。
[0049] (4)棄上清，加75%己醇0. 5ml，搖振，充分洗漆沉淀，離屯、12000巧mX5min。
[0050] 妨徹底吸去上清，沉淀置于37°C干燥5min，加入20-40 y 1 DEPC水溶解沉淀。
[(K)川 3.逆轉錄腳）反應
[0化引 取12yl總RNA，加入lyl A液，混勻后置于PCR儀上，70°C，5分鐘。立即置 于-20°C冰箱中，3min 后取出，加入 1 y 1 RNasin(20U/ y 1)、1 y ldNTPs(10mM/each)、4 y 1 5XRT BufferU y 1 M-MLV逆轉錄酶（200U/ y 1)，總反應體積為20 y 1，混勻，在PCR儀上， 37°C 45分鐘，溫育結束后進行下一步操作或置于-20°C保存。
[005引 4.多重巢式PCR
[0化4] 采用廣泛表達的轉錄因子增強子結合因子基因（E2A)的mRNA作為陽性內對照。
[0055] 巢式第一輪PCR(25 y 1體系）；各取患者cDNA、陰性對照D液和陽性對照E液 2yl，各取 B 液 22^1，化9 DNA 聚合酶0. 5yl(1.25U)。PCR條件為；95°C 5min 后，95°C 變 性30s，58°C退火30s，72°C延伸lOmin，共30個循環，結束反應。
[0056] 巢式第二輪PCR(25yl體系）；各取C液22yl，相應的第1輪PCR產物2yl，I'aq DM聚合酶0. 5 y 1 (1. 25U)。PCR反應條件同第一輪。
[0057] 5. PCR擴增產物分析
[0化引 1 %瓊脂糖凝膠恒壓100伏電泳40min，邸染色，紫外燈下觀察并照相。
[0059] 6.結果判讀：
[0060] 根據表3,判讀患者的BCR/A化融合基因的不同剪接體。圖1為陰性對照（陽性內 對照）、陽性對照-BCR/ABL b3a2陽性K562細胞系、BCR/ABL b3a2陽性患者、BCR/ABL ela2 陽性患者、BCR/ABL b2a2陽性患者檢測結果。
[0061] 表1.特異性逆轉錄引物
[0062]
【主權項】
1. 一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因及其不同剪接突變體的方法，其 特征在于，包括如下步驟： (1) A液：特異性逆轉錄引物 引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀釋混勻，濃度為2. 5pmol/ μ 1 (引物序列 見表1); B液：巢式第一輪PCR反應液500 μ 1 (20測試）： 包含引物為出0?-1、80?-3、481^-1324-1324-3;(引物序列見表2) 第一輪多重 PCR 引物 IOOpmol/條，緩沖體系為：Tris-HCL(PH8. 3)8. 8ΜΜ、KCL 44ΜΜ、 dNTPs 0.16MM/each、MgCL2 1.32MM，儲存于-20°C，備用。 C液：巢式第二輪PCR反應液500 μ 1 (20測試）： 包含引物為出0?-2、80?-4、六81^-232六-232六-4;(引物序列見表2) 各組第二輪多重？〇?引物125?111〇1/條，反應緩沖體系為：1^8-!0^(?!18.3)9.6麗、1((^ 48mm、dNTPs 0· 192MM/each、MgCL2 I. 44ΜΜ，儲存于-20°C，備用。 D液：陰性對照（陽性內對照）健康人外周血單個核細胞cDNA溶液； E液：陽性對照-BCR/ABL b3a2陽性K562細胞系cDNA溶液； F液：陽性對照-BCR/ABL ela2陽性患者cDNA溶液； G液：陽性對照-BCR/ABL b2a2陽性患者cDNA溶液； (2) 采用廣泛表達的轉錄因子增強子結合因子基因（E2A)的mRNA作為陽性內對照； (3) 巢式第一輪PCR(25 μ 1體系）：各取患者cDNA、陰性對照D液和陽性對照E液2 μ 1， 各取8液2241，了39〇嫩聚合酶0.5以1(1.25扔，？0?條件為：95°〇51^11后，95°〇變性3〇8， 58°C退火30s，72°C延伸lOmin，共30個循環，結束反應； (4) 巢式第二輪PCR(25μl體系）：各取C液22μl，相應的第l輪PCR產物2 μl，Taq DNA聚合酶0. 5 μ I (I. 25U)。PCR反應條件同第一輪。
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因及其剪切突變體的方法，采用特異性的反轉錄引物，提高反轉錄效率，采用多重巢式PCR方式增加PCR效果，較短時間內快速檢測出BCR/ABL融合基因及其不同剪切突變體，為疾病的早期診斷及靶向治療提供依據。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104630343
【申請號】CN201410725610
【發明人】高廣勛
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2014年12月5日