肺炎支原體23S rRNA 2064位點A:G突變檢測特異性引物和探針的制作方法
【專利說明】肺炎支原體23S rRNA 2064位點A:G突變檢測特異性引物和探針
[0001]
技術領域
[0002]本發明是一種用于檢測肺炎支原體23S rRNA 2064位點A:G突變的特異性引物和探針。
[0003]
【背景技術】
[0004]肺炎支原體是一種常見的呼吸道病原體,通常導致輕微的上呼吸道感染，如喉嚨痛、咽喉炎和氣管炎，其引起的肺炎占非細菌性肺炎的50%，還可引起肺外并發癥，累及一個或多個系統、器官，如皮膚、胃腸道、心血管、骨骼肌肉和腎臟，嚴重時可致中樞和外周神經系統病變，甚至死亡。通過飛沫以氣溶膠形式傳播，存留在鼻、喉、氣管和痰液中，密切接觸可能引起肺炎支原體的暴發。肺炎支原體無細胞壁，對影響細胞壁合成的抗生素如青霉素等不敏感，但是對影響細菌蛋白合成的抗生素如大環內酯類、喹諾酮類等敏感。大環內酯類是治療肺炎支原體感染的首選藥物，可結合于肺炎支原體核糖體50S亞基的轉肽酶中心與肽輸出通道之間的部分，通過機械阻塞通道而抑制肽鏈的延伸，從而達到抑制蛋白合成的目的，其結合位點由23S rRNA結構域V的核苷酸構成，其中2064位點是主要的組成部分。近年來，隨著大環內酯類抗生素的廣泛使用，臨床分離出了耐藥菌株，提示肺炎支原體耐藥現象的存在。國內外的研究表明，產生耐藥的肺炎支原體在23S rRNA序列上發生點突變，其中最常見的是2064位點A到G的突變。
[0005]目前，臨床上對肺炎支原體耐藥性的檢查，主要是依靠肺炎支原體的分離及藥敏實驗，由于肺炎支原體分離較為困難，所以靈敏度較低，而且耗時耗力，不利于及時指導用藥。本發明采用的熒光PCR技術，操作簡便、檢測迅速、檢出率高，通過一次試驗即可明確是否有耐藥肺炎支原體的感染，有利于對疾病進行及時診斷及合理選擇治療方案，與傳統分離培養檢測技術相比，提高了檢出效率、降低了漏檢率。可對多種臨床樣本進行高效可靠的篩查，以及對臨床病情和用藥效果進行監測，指導合理用藥。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種用于檢測肺炎支原體23S rRNA 2064位點A:G突變的引物和探針。
[0007]基于上述目的，本發明采用以下技術方案:
用于檢測肺炎支原體23S rRNA 2064位點A:G突變的特異性引物和探針序列包括:上游引物MPF序列為5’ GGTGTAACCATCTCTTGA 3’，下游引物MPR序列為5’CCTGATCAATATTAAGCTACAG 3’ 和探針 2064P 序列為 5’ FAM CGGGGTCTCTCCGTCC BHQl 3’。
[0008]本發明的具體原理是利用一對靶核酸序列的特異性引物和探針，采用實時熒光定量PCR技術，通過PCR實現靶核酸序列片斷的擴增。所使用的探針為兩端分別標記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發出的熒光被淬滅基團吸收，在PCR擴增過程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性將特異結合在靶核苷酸片斷上的熒光探針酶切降解，使報告基團的熒光信號可以被檢測，熒光信號量的變化與擴增產物量成正比，從而可以通過熒光強弱來判斷待測樣本中靶核苷酸序列的存在。
[0009]
【附圖說明】
[0010]圖1是利用引物對MPF/MPR和探針2064P檢測肺炎支原體23S rRNA 2064位點A:G突變陽性樣本的熒光PCR擴增圖。
[0011]
【具體實施方式】
[0012]1.引物和探針的設計:通過分別對所有已知的肺炎支原體23S rDNA序列進行比較分析，選擇2064位點所在區段，設計多對引物和探針，引物長度一般為20堿基左右。最優引物探針序列組合如下:
上游引物 MPF: 5 ’ GGTGTAACCATCTCTTGA 3，
下游引物 MPR: 5’ CCTGATCAATATTAAGCTACAG 3’
探針 2064P: 5’ FAM CGGGGTCTCTCCGTCC BHQl 3’。
[0013]2.反應體系的優化:利用臨床分離的耐藥肺炎支原體滅活液作為待檢樣品，用磁珠裂解法抽提肺炎支原體核酸，分裝后貯存于一 80°C。
[0014]2.1引物濃度的優化在反應體系中其它條件相同的情況下，將肺炎支原體引物濃度分別從0.1 μ mol/L至1.6 μ mol/L作倍比連續稀釋,通過對試驗結果的分析比較,確定最佳引物濃度是0.2 μ mol/L。
[0015]2.2探針濃度的優化在反應體系中其它條件相同的情況下，將肺炎支原體突變檢測用探針濃度分別從0.1 μ mol/L至0.5 μ mol/L作倍比連續稀釋，通過對試驗結果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.2 μ mol/L。
[0016]利用上述引物和探針進行反應體系的建立，最后確定采用的肺炎支原體23S rRNA2064位點A:G突變的實時熒光PCR反應體系為25 μ L。按照熒光定量PCR試劑盒說明進行反應液的配置。
[0017]3.儀器檢測通道的選擇
選擇的熒光檢測通道應與探針所標記的報告熒光基團一致，具體按照儀器使用說明書進行設置。
[0018]4.PCR反應條件如下
500C 2min 進行 UNG 酶反應；95°C lmin, I 個循環；91 °C 15s，64°C lmin,40 個循環，在64°C Imin階段收集熒光。
[0019]5.檢測結果分析
如果待檢樣本中含有發生2064位點A:G突變的肺炎支原體，則顯示陽性擴增曲線，其檢測靈敏度可以達到1000 copies/mL，如果待檢樣本中沒有2064位點A:G突變的肺炎支原體，則顯示陰性擴增曲線，即無擴增信號，提示上述引物和探針具有良好的特異性和靈敏度。
[0020]本發明的優點在于:
(I)本發明提供的引物和探針的檢測靈敏度可以達到1000 copies/mL，說明其靈敏度良好。
[0021](2)本發明提供的引物和探針對不含2064位點A:G突變的肺炎支原體的樣本沒有檢測信號，說明其特異性強。
[0022](3)由于本發明是針對2064A:G突變位點，進行了程序和體系優化，避免了假陰性和假陽性結果的出現。
【主權項】
1.一種用于檢測和鑒定肺炎支原體23S rRNA 2064位點A:G突變的特異性引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物MPF序列為5’ GGTGTAACCATCTCTTGA 3’，下游弓 I 物 MPR 序列為 5 ’ CCTGATCAATATTAAGCTACAG 3 ’。
2.一種用于檢測和鑒定肺炎支原體23S rRNA 2064位點A:G突變的特異性探針序列，其特征在于所述的探針序列為5’FAM CGGGGTCTCTCCGTCC BHQl 3’。
【專利摘要】本發明公開一種用于肺炎支原體23SrRNA2064位點A:G突變的特異性引物和探針，屬于生物技術領域，核苷酸序列包括上游引物MPF序列為5’GGTGTAACCATCTCTTGA3’，下游引物MPR序列為5’CCTGATCAATATTAAGCTACAG3’和探針2064P序列為5’FAMCGGGGTCTCTCCGTCCBHQ13’。
【IPC分類】C12N15-11, C12R1-35, C12Q1-68
【公開號】CN104630328
【申請號】CN201310550193
【發明人】杜君卿, 李楊霞
【申請人】江蘇默樂生物科技有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月8日