一種循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，具體設及一種循環使用培養液提高微藻油脂產量的方 法。
【背景技術】
[0002] 微藻是一類可光合自養的微生物，含有豐富的蛋白質、多不飽和脂肪酸、色素等營 養物質。同時，因其具有生長速度快、單位體積脂肪酸產量高等優點，在生物飼料、生物制 藥、保健品及生物燃料等諸多領域都有廣泛的應用前景。在微藻大規模培養中需要使用大 量的培養液，也即需要使用大量的水，該些培養液提供微藻生長所必須的營養成分。但微藻 收獲后，大量剩余的培養液如果直接丟棄，既造成水資源浪費，也會造成水體污染，不利于 環保。所W微藻培養液的循環使用很有必要，一方面可W節約水資源，另一方面，可W減少 污水排放，減少對環境的影響。
[0003] 但是，微藻培養收獲后的上層清液直接用于微藻的循環培養，可能會不利于微藻 的生長，因為在微藻生長過程中可能會產生有害物質，該些有害物質存在于上層清液中，不 經處理直接用于微藻再一次培養，可能會抑制微藻生長。因此，尋找一種有效經濟環保的微 藻培養液循環使用方法，很有意義。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是：提供一種微藻培養液循環使用的方法，該種方法不 僅能提高微藻培養液循環利用的次數，還能提高微藻的生物量和產油量。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：
[0006] 一種微藻培養液循環使用的方法，該方法包括如下步驟：
[0007] (1)配制微藻標準培養基；
[000引 （2)向步驟（1)的微藻標準培養基中接入微藻種子液，然后培養至微藻生長的穩 定期，得到微藻混合物；
[0009] (3)將步驟（2)得到的微藻混合物離屯、處理，分別收集微藻和培養液，向培養液中 加入吸附劑，攬拌處理，然后過濾去除吸附劑，收集上清液；
[0010] (4)將步驟（3)得到的上清液作為溶劑配制微藻循環培養基，將該循環培養基作 為下一次微藻培養的培養基；
[0011] 妨重復步驟似~（4)。
[0012] 其中，步驟（1)和步驟（4)中，所述的微藻標準培養基為TAP培養基，。
[0013] 其中，步驟（2)中，所述的微藻為淡水小球藻。
[0014] 其中，步驟（3)中，所述的吸附劑為娃藻±、沸石中的一種或兩種的混合物，優選 的吸附劑為娃藻上。
[0015] 其中，步驟（3)中，吸附劑與培養液的比例為0. 5~5g aoomu優選為2g ;100血。
[0016] 其中，步驟（3)中，所述的攬拌處理，攬拌時間為2~她，攬拌速度為50-120轉/ 分鐘，優選為100轉/分鐘。
[0017] 步驟（4)中，循環培養基中加入的各營養成分的含量是微藻標準培養基的3/4,。 [001引其中，步驟巧）中，步驟（2)~（4)重復次數為3次。
[0019] 該種加入沸石和娃藻±處理后的循環培養基能提高微藻油脂產量的機理在于，每 次向循環培養基中加入的營養物質只有標準微藻培養基中含有營養物質的3/4,導致循環 培養基中氮素缺乏，從而對微藻的生長環境造成氮素不足的脅迫，因此促進微藻油脂積累。 另一方面，加入的吸附劑能夠去除培養液中的生長抑制物質，降低培養基中抑制物對微藻 生長的抑制作用，使微藻的生物量能維持在較高的水平，最終提高了微藻油脂產量。
[0020] 有益效果：
[0021] 1、本發明微藻培養收獲后，將剩余上清液利用沸石或娃藻±吸附其中的有害物 質，再將其作為下一次培養的溶劑，減少廢水排放，有利于環保。
[0022] 2、本發明有效利用了微藻培養基中未被利用的營養物質，且每次循環只補充3/4 的營養成分，降低微藻培養的成本，每次循環培養減少使用新鮮水作為培養水體，從而降低 微藻培養的成本。
[0023] 3、本發明可W顯著提高微藻油脂產量，經過每次循環后，養分積累且不平衡的脅 迫效應（如氮素相對缺乏）致使油脂積累，同時吸附劑去除生長抑制物質導致生物量不降 低。
【具體實施方式】
[0024] 根據下述實施例，可W更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0025] W下實施例中所用的微藻為淡水小球藻化lorella sorokinina LS-2,菌種保藏 登記號為CGMCC 8710。
[0026] W下實施例中所用的TAP培養基（每升）配方如下；400.0 Omg畑典1， 50.0 Omg CaCl2*2H2〇，100.0 Omg M拆〇4*7&0,98. 80mgNa2HP〇4,61. 73mg 陸2口〇4,50.0 Omg Na^EDTA ? 2馬0, 22. OOmg ZnS〇4 ? 7馬0, 11. 40mg H3BO3, 5. lOmg MnCls ? 4馬0, 5. 00m咨 FeS〇4 ?7馬0,1. 60mg CoCls ?6馬0,1. 16mg CuS〇4 ?5馬0,1. 10mg(NH4)6M〇7〇24 ?4馬0,2420. 00m咨 Tris Base，1ml Glacial Acetic Acid。
[0027] W下實施例中微藻的油脂通過W下方法得到；向所得的微藻干品中加入5ml濃鹽 酸（質量濃度36% -38% )，混勻，70°C水浴中放置20min，加入5ml無水己醇，靜置冷卻后 再向體系中加入5血己離，振蕩Imin，400化pm離屯、2min，獲得上層己離相和下層沉淀，將上 層己離相移出，向下層沉淀中加入5血的己離，振蕩Imin，400化pm離屯、2min，再將上層己 離相移出，合并所有上層己離相，減壓濃縮脫除溶劑，獲得藻油并稱重。微藻油脂含量（％) =油脂重量/微藻干品重量*100。
[002引 W下實施例中微藻干品的重量指用于提油的微藻藻粉質量，通過微藻細胞在 680nm下的吸光度可W判斷微藻的生長狀況，待微藻生長至穩定期，將藻細胞搖勻，取20~ 200ml藻液8000巧m離屯、3min，去除上清液，將所獲得的藻泥在70°C下干燥12h，獲得微藻 干品，換算成每L藻液中微藻干品質量，表示為微藻生物量（g/L)。
[0029] W下實施例中微藻產油量（g/L)=微藻生物量（g/L)x油脂含量（％ )。
[0030] 實施例1 ;
[003U 配制TAP培養基，按100血/瓶分裝到250血的錐形瓶中，滅菌。按照接種量為4% 接入新鮮的穩定期采收的淡水小球藻化lorella sorokinina LS-2,培養至穩定期（約7 天），培養條件設為溫度26°C、光照強度30001UX，光暗周期Hh/lOh。
[0032] 將微藻培養物離屯、處理，分別收集微藻泥和上清液，再對上清液做如下處理；1號 錐形瓶的上清液不做任何處理，直接作為溶劑配制循環培養基，加入上清液中的各培養基 的組分均減為標準TAP培養基的3/4 ;2號錐形瓶的上清液中按100mL:2g比例加入娃藻 ±，在100轉/分鐘條件下攬拌化，再經離屯、除去娃藻±，將其作為溶劑配制循環培養基， 加入上清液中的各培養基的組分均減為標準TAP培養基的3/4 ;3號錐形瓶的上清液中按 100mL:2g比例加入沸石，在100轉/分鐘條件下攬拌6h，再經離屯、去除沸石，將其作為溶 劑配制循環培養基，加入上清液中的各培養基的組分均減為標準TAP培養基的3/4 ;4號錐 形瓶的上清液中按lOOmL: 2g比例加入娃藻±，在100轉/分鐘條件下攬拌化，再經離屯、去 除娃藻±，將其作為溶劑配制循環培養基，加入上清液中的各培養基的組分均減為標準TAP 培養基的1/2 ;分別向上述1-4號錐形瓶中接入4%新鮮的穩定期采收的淡水小球藻。重復 上述實驗步驟2次，即循環培養3次，加上初次的完全新鮮TAP培養基培養，共培養4次。
[0033] 為了保證不同批次間的實驗結果具有可比性，除了維持相同的光溫培養條件外， 還將每次實驗中4%微藻初始接種量嚴格標定為0D = 0. 06化80nm下測得）。
[0034] 每次培養后，取20血藻液離屯、烘干測藻干重（即生物量），另外80血藻液中的微 藻用于測產油量。檢測結果如表1所示。
[0035] 表1錐形瓶生物反應器中循環使用培養液對微藻生物量、油脂含量及產油量的影 響
[0036]
【主權項】
1. 一種循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，該方法包括如下步 驟： (1) 配制微藻標準培養基； (2) 向步驟（1)的標準培養基中接入微藻種子液，培養至微藻生長的穩定期，得到微藻 混合物； (3) 將步驟（2)得到的微藻混合物離心處理，分別收集微藻和培養液，向培養液中加入 吸附劑，攪拌處理，然后過濾去除吸附劑，收集上清液； (4) 將步驟（3)得到的上清液作為溶劑配制微藻循環培養基，將該循環培養基作為下 一次微藻培養的培養基； (5) 重復步驟⑵~（4)。
2. 根據權利要求1所述的循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，步 驟（1))中，所述的微藻標準培養基為TAP培養基。
3. 根據權利要求1所述的循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，步 驟（2)中，所述的微藻為淡水小球藻。
4. 根據權利要求1所述的循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，步 驟（3)中，所述的吸附劑為硅藻土和沸石中的任意一種或兩種的混合物。
5. 根據權利要求1所述的循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，步 驟⑶中，吸附劑質量與培養液體積的比例為0. 5~5g : IOOmL加入。
6. 根據權利要求1所述的循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，步 驟（3)中，所述的攪拌處理，攪拌時間為2~8h，攪拌速度為50~120轉/分鐘。
7. 根據權利要求1所述的循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，步 驟（4)中，循環培養基中加入各營養成分的含量是微藻標準培養基的3/4。
8. 根據權利要求1所述的循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，步 驟（5)中，步驟⑵~⑷重復次數為3次。
9. 根據權利要求1所述的循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，反 應過程中使用生物反應器。
10. 根據權利要求1所述的循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，其特征在于，所 述的生物反應器為錐形瓶光生物反應器或者垂袋光生物反應器。
【專利摘要】本發明提供了一種循環使用培養液提高微藻油脂產量的方法，該方法包括如下步驟：(1)配制微藻培養基；(2)向微藻培養基中接入微藻種子液，培養至微藻生長的穩定期，得到微藻混合物；(3)將微藻混合物離心處理，分別收集微藻和培養液，向培養液中加入吸附劑，攪拌處理，然后過濾去除吸附劑，收集上清液；(4)將步驟(3)得到的上清液作為溶劑配制微藻循環培養基，得到循環培養基，將該循環培養基作為下一次培養的培養基；(5)重復步驟(2)～(4)。該方法循環利用微藻培養基，不僅能夠節約培養的成本，還能減少廢水排放，實現節能減排，并且每次循環培養，微藻的生物量、產油量與新鮮培養基相比有一定提高。
【IPC分類】C12R1-89, C12P7-64
【公開號】CN104630294
【申請號】CN201510083398
【發明人】李敏, 陳以峰
【申請人】南京以標能源有限責任公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月16日