基因的重組沙門氏菌的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體設及一種包含豬流行性腹瀉病毒S4gg_ew基因重組 沙口氏菌。
【背景技術】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉疾病（Porcine epidemic diarrhea, PED)的病 原，該病W產房1-7日齡仔豬淡黃色水樣腹瀉、嚴重脫水為主，剖檢可見仔豬腸道內脹氣、 有黃色乳凝塊。陽DV主要通過糞-口途徑傳播，產房仔豬通過消化道攝入病毒后，病毒主要 入侵空腸和回腸部位小腸黏膜上皮細胞，并開始病毒復制。PEDV的感染導致上皮細胞膜表 面的雙糖酶（乳糖酶、庶糖酶、麥芽糖酶）、氨膚酶、堿性磯酸酶的活性下降；同時，腸絨毛上 皮細胞正常結構破壞并發生細胞破碎，造成腸絨毛萎縮，腸道表面積減少，從而導致小腸消 化不良、吸收不良等機能障礙，誘發仔豬發生腹瀉并脫水。
[0003] PEDV最早在英國發現，并流行于歐洲從上世紀八十年代W后，中國、日本、韓國也 開始有所報導。2010年至今，該病已廣泛流行于中國、韓國、泰國、美國等國。該病對產房仔 豬極高的發病率和致死率、較高的治療成本及防控成本，W及病毒基因發生變異造成強毒 株的出現，對世界養豬業造成了巨大的損失。
[0004] 隨著陽DV分子生物學研究的深入，陽DV免疫機理基本清楚，屬于典型的局部黏膜 免疫為主，存在于血清中陽DV IgG不能提供有效保護，而腸道黏膜免疫所產生的分泌型抗 體（SIgA)才能抵抗PEDV感染，仔豬通過初乳來獲得母源SIgA，從而產生對流行性腹瀉的被 動免疫保護。
[0005] 目前大多都是傳統型滅活苗和弱毒苗，但是它存在毒力返強及散毒的風險，需要 改進。為了研制出更為安全、高效、成本低廉、保存和使用方法簡易的豬流行性腹瀉疫苗，人 們開始利用基因工程手段開發黏膜免疫疫苗，W期達到進一步預防和控制該病的目的。如， 徐麗麗等構建了可表達PEDV S蛋白C0E區域、SD區域的減毒沙口氏菌重組疫苗，其包含的 抗原基因長，菌株穩定性越差，同時其包含crp毒力基因，安全性難W保證。
【發明內容】
[0006] 為了解決上述問題，本發明提供了一種新的重組沙口氏菌。
[0007] 本發明提供了一種如SEQ ID NO ;1所示的核巧酸序列。
[000引本發明提供了一種如SEQ ID NO ;1所示的核巧酸序列。
[0009] 本發明重組載體，包含SEQ ID NO ;1所示的核巧酸序列。優選地，所述的重組載體 是重組pVAXl。
[0010] 本發明重組菌，其特征在于：它包含權利要求2或者3所述的重組載體。
[0011] 所述的重組菌為重組沙口氏菌或者重組大腸桿菌。
[0012] 所述的重組沙口氏菌為重組減毒沙口氏菌化7207。
[001引本發明還提供了一種重組蛋白，它是由SEQ ID NO ;1所示的核巧酸序列編碼。它 的氨基酸序列如SEQ ID NO ;2所示。
[0014] 陽DV 8姑9_日日。核巧酸序列（SEQ ID N0;1);
[0015] gttactttgccatcat ttaatgatca ttcttttgtt aatattactg tctctgcggc ttttggtggt
[0016] cttagtagtg ccaatctcgt tgcatctgac actactatca atgggtttag ttctttctgt
[0017] gttgacacta gacaatttac cattacactg ttttataatg ttacaaacag ttatggttat
[0018] gtgtctaaat cacaggatag taattgtcct ttcaccttgc aatctgttaa tgattacctg
[0019] tcttttagca aattttgtgt ttcaaccagc cttttggctg gtgcttgtac catagatctt
[0020] tttggttacc ctgcgttcgg tagtggtgtt aagttgacgt ccctttattt tcaattcaca
[0021] aaaggtgagt tgattactgg cacgcctaaa ccacttgaag gtatcacaga cgtttctttt
[0022] atgactctggatgtgtgtac caagtatact
[002引對應的S499_es。氨基酸序列（SEQ ID NO試；
[0024] VKLVKAKARGPRQAGICEVRYTSLVVGSTTKVVSKRVEMNV 化 VVVD 抓 VTLNTTGRTVVVDGLAF FESDGFY 畑 LADADVVIEHPVYKSAC 化 KPVFECDPIPDF 化 PVAASVA 化 CVQTDIXLKNYNTPYKTYSCWRG DKCCITCTLQ
[0025] 在研究過程中，發明人根據經驗選擇S蛋白的第499-650段基因片段，制備得到了 免疫原性非常強的重組菌株，其產生的針對豬流行性腹瀉病毒特異性SIgA抗體高于滅活 疫苗，可W有效預防豬流行性腹瀉疾病，取得了意料不到的技術效果。
[0026] 本發明包含SEQ ID NO ;1所示核巧酸序列的重組沙口氏菌免疫豬后，可W產生大 量針對豬流行性腹瀉病毒特異性SIgA抗體，用其制備的疫苗對豬流行性腹瀉病毒為豬流 行性腹瀉疾病有良好的保護作用，且SEQ ID NO; 1所示核巧酸序列短，制備的重組菌株穩定 性好，不包含crp毒力基因，安全性好，臨床應用前景優良。
[0027] W下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于W下的實施例。凡基于本發明上述內 容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[00測圖1S徐閒。基因擴增。M ;DNA Marker III ;1，2 ;S 499-日日。基因擴增；
[0029] 圖化MD19-T-S499-65。的鑒定。M;DNA Marker III ;1 ;S 499-65。基因擴增； 2:pMDl9_T-S徐e日。雙酶切鑒定；
[0030] 圖化VAX-S柳_日日。的鑒定。M ;DNA Marker III ;1 記 499-日日0基因擴增；2 ;pVAX-S 499-65〇 雙酶切鑒定；
[00川圖4pVAX-S4gg_e日康達產物的間接免疫巧光鑒定。A ;轉染pVAX-S 499-日日。的COS-7細 胞；B ;轉染pVAXl的C0S-7細胞；
[00對 圖5pVAX-S499-65康達產物的免疫印跡鑒定。M ;蛋白Marker ;1 ;轉染pVAXl的C0S-7 細胞；2 ;轉染 pVAX-S4gg_e。。的 C0S-7 細胞；
[003引 圖6SL7207 (pVAX-S柳_日日。）菌株的鑒定。M ;DNA Marker III ;1 ;S柳_日日。基因擴增；2 ; pVAX-S4gg_e5。雙酶切；3 ;沙口氏菌鑒定；
[0034] 圖7重組減毒沙口菌株的生長曲線；
[0035] 圖8重組沙口菌株的體外穩定性分析；
[0036] 圖9重組沙口菌株的體內穩定性分析；
[0037] 圖10RT-PCR檢測S基因在小鼠腸道內的轉錄。M;DNA Marker III ;1，2,3,4 ;接 種化7207 (pVAX-S4gg_e日。）后 1，3, 5, 7 天；5, 6, 7, 8 ;接種化7207 (pVA幻后 1，3, 5, 7 天；
[003引圖11重組沙口氏菌菌株在脾臟和肝臟中的增殖，A是脾臟，B是肝臟；
[0039] 圖12重組減毒沙口氏菌的小鼠安全性分析。A ;腸壁固有層與肌層分離巧；小腸 絨毛杯狀細胞增多；C ;小腸絨毛脫落；D ;PBS對照組小鼠回腸切片；
[0040] 圖13免疫仔豬T淋己細胞增殖實驗（沖<0. 01);
[0041] 圖14免疫仔豬血清樣品中抗陽DV IgG的檢測（沖<0. 01);
[0042] 圖15免疫仔豬黏膜樣品中抗陽DV IgA的檢測（沖<0. 01);
[0043] 圖16特異性抗體的病毒中和實驗。A血清抗體IgG的病毒瞻斑減少分析 (沖<0. 01) ;B黏膜抗體IgA的病毒瞻斑減少分析（沖<0. 01);
[0044] 圖17免疫仔豬血清IFN-丫的測定。A IFN-丫標準品的線性回歸方程；B血清中 IFN-丫水平的變化（沖<0. 01);
[0045] 圖18免疫仔豬血清IL-4的測定。A IL-4標準品的線性回歸方程巧血清中IL-4 水平的變化。
【具體實施方式】
[0046] 實驗材料和試劑；
[0047] 1 材料
[0048] 1. 1菌株、毒株及實驗動物
[0049] 豬流行性腹瀉病毒疫苗株（CV777株）、豬流行性腹瀉病毒株，購自中國獸藥監察 所或四川農業大學動物傳染病室分離保存；大腸桿菌D冊a，購自北京天根生物制品有限 公司；減毒鼠傷寒沙口菌化7207由由德國Helmholtz感染研究中屯、Kai Schulze教授饋 贈，COS-7細胞、Vero細胞均購自武漢大學保藏中屯、均由實驗室提供；、pVAXl質粒，購自美 國Invitrogen公司；；BALB/c小鼠（雌性，6周齡，清潔級）購自成都生物制品研究所，20 日齡仔豬購自雅安某無PEDV、TGEV、豬輪狀病毒感染史豬場。
[0化日]1. 2主要試劑
[0化^ 兔抗陽DV陽性血清由本室制備保存；限制性內切酶、PMD19-T simple Vector、 T4DNA連接酶、反轉錄試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司產品；RNA抽提試劑盒瓊脂糖去 內毒素質粒提取試劑盒化do-Free Plasmid Mini Kit、質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收 試劑盒購自美國OMEGA公司；2X化q PCR Master Mix、TMB底物溶液、DNA分子量標準等， 北京天根生物技術有限公司產品RPMI1640, GIBC0公司產品；小鼠用淋己細胞分離液，天津 漫IT洋生物制品科技有限責任公司產品；肝素鋼、ConA、MTT，Amresco公司產品；HRP標記的 羊抗兔IgG酶標二抗，Sigma公司產品；FITC標記羊抗兔IgG抗體為北京博奧森公司產品； Anti-P邸V IgG檢測試劑盒、anti-P邸V IgA檢測試劑盒、細胞因子丫 -干擾素檢測試劑盒、 IL-4檢測試劑盒，均為美國R&D公司產品。
[0化2] 1. 3主要儀器
[0053] Legend Micro 17R centrifuge離屯、機、恒溫振蕩培養箱，美國Thermo公司產品； E化IPSE TE2000-U型巧光倒置顯微鏡，日本Nickon公司產品；半干轉印儀、Gene Pulser Xcell電轉儀、My切clerTM PCR儀、PO肥R Pac TM電泳儀及水平電泳槽、UNIVERSAL冊OD凝 膠成像系統、SmartspecTM Plus核酸蛋白儀、Model 680酶標儀，美國BIO-RAD公司產品； Water Pro Plus超純水儀，美國LABC0NC0公司產品。
[0054] 實施例1本發明重組菌的構建 [00巧]1陽DV S柳_日日。基因的克隆
[0056] 1.1引物設計
[0057] 參照GenBank公布的陽DV的S基因cDNA序列（序列號；KC886306)，利用Primer 5.0設計引物如下（表1)，其中P1/P2用于擴增S4gg_ew基因。引物由大連寶生物工程有限 公司合成。
[005引表1 S499_es基因的擴增引物序列及酶切位點標示
[0059]
【主權項】
1. 一種如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2. -種重組載體，其特征在于：包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
3. 根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于：所述的重組載體是重組pVAXl。
4. 一種重組菌，其特征在于：它包含權利要求2或者3所述的重組載體。
5. 根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于：所述的重組菌為重組沙門氏菌或重組 大腸桿菌。
6. 根據權利要求5所述的重組菌，其特征在于：所述的重組沙門氏菌為重組減毒沙門 氏菌 SL7207。
7. -種重組蛋白，其特征在于：它是由權利要求1所述核苷酸序列編碼。
8. 根據權利要求7所述的重組蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所 不O
【專利摘要】本發明公開了一種如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，公開了包含該核苷酸序列的重組載體、重組菌。本發明包含S499-650基因重組沙門氏菌免疫產生的針對豬流行性腹瀉病毒的特異性抗體水平高，對豬流行性腹瀉疾病有良好的保護作用，臨床應用前景優良。
【IPC分類】C12N15-74, C12N15-50, C12N15-70, C12R1-19, C12R1-42, C07K14-165, C12N1-21
【公開號】CN104630240
【申請號】CN201510058690
【發明人】文翼平, 黃小波, 梁恩濤, 文心田, 曹三杰, 伍銳, 陳杰, 張雨迪, 段素芬, 朱書權
【申請人】四川農業大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月4日