一種發酵生產重組牛虻抗血栓酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥技術領域，涉及重組牛虻抗血栓酶kfpase的發酵制備方法。
【背景技術】
[0002]血栓栓塞性疾病嚴重影響人類的健康，是導致死亡率最高的病因之一。在過去的幾十年中，已經開發了針對血液凝固、血小板激活和聚集、血栓溶解的不同步驟而起作用的基礎和臨床藥物，但是很多抗血栓藥物經常被包括低血壓、出血等系統性的副作用所限制，因此，需要開發新型的更具潛力和特異性的抗血栓藥物。
[0003]牛虻抗血栓酶kfpase為一種單鏈蛋白，其表觀分子量為27kDa。實驗表明牛虻抗血栓酶kfpase能水解纖維蛋白原和抑制血小板聚集，能抑制角叉菜膠誘導的鼠尾靜脈血栓形成，且無出血活性。應用于ADP誘導的人血小板聚集試驗具有明顯的抗血小板聚集的作用。該工作對有潛力開發成為新型單組份抗血栓藥物的牛虻抗血栓酶kfpase進行了較為系統的理化性質研究，為該酶的進一步開發和研究奠定了基礎。
[0004]大腸桿菌是基因工程中常用的宿主菌，許多有價值的蛋白在大腸桿菌中已成功地進行了表達，且外源蛋白表達量較高。大腸桿菌作為外源基因表達的宿主，由于具有遺傳背景清楚，目的基因表達水平高，技術操作、培養條件簡單、抗污染能力強、大規模發酵成本低等優點，倍受遺傳工程專家重視，是目前應用最廣泛，最成功的表達體系。本發明提供的發酵方法使得重組牛虻抗血栓酶kfpase的蛋白表達量在IPTG誘導表達3h后就能夠達到總蛋白的30%以上。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種發酵生產重組牛虻抗血栓酶kfpase的方法，包括:(I)構建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表達工程菌株，(2) 一級種子的培養，(3) 二級種子的培養，(4)上罐發酵，(5)離心發酵液收集菌泥，進行純化。其特征在于，在上罐發酵過程中，參數設置為PH值為6.5-8.0，溶氧值為不小于20%，生長溫度為30°C _37°C，誘導期溫度為250C _37°C。通過該方法可以有效地表達重組牛虻抗血栓酶，該方法具有操作簡單，蛋白表達量高，周期短等特點。
[0006]本發明提供的技術方案為提供一種發酵生產重組牛虻抗血栓酶kfpase的方法，包括:(1)構建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表達工程菌株，(2) 一級種子的培養，(3) 二級種子的培養，(4)上罐發酵，(5)離心發酵液收集菌泥，進行純化。其特征在于，在上罐發酵過程中，參數設置為pH值為6.5-8.0，溶氧值為不小于20%，生長溫度為30°C _37°C，誘導期溫度為25°C -37°C。
[0007]本發明提供的發酵方法適用于常規分子生物學技術構建的kfpase工程菌株。具體地，本發明提供的工程菌為，將kfpase基因正確置于酵母表達載體pet30a，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，經篩選建立表達kfpase的工程菌株。然后經過常規的生產技術，進行菌株的活化，即將凍存的甘油管菌株，挑取少許在固體培養基(LB)上劃線，37°C培養12-16h，長出大小適宜的單菌落，取出4°C保存。
[0008]一級種子的制備，挑取平板單菌落接種到三角搖瓶中，培養基為LB，37°C，200rpm，培養 7-9h0 0D600 為 1-2。
[0009]二級種子的制備，以I %的接種量接種二級種子，培養基為LB，37°C，200rpm，培養14-18h。0D600 為 3-5。
[0010]上罐發酵過程:
[0011](I) 4.5發酵培養基組成
[0012]稱取glucose22.5g, yeast extract49.5g, tryptone85.5g, MgS044.5g,KH2PO413.5g, K2HPO4.3H2081g, (NH4) 2S0418g，溶于 4L 水中，定容 4.5L。
[0013](2)待發酵罐滅菌，降溫至37°C，調整參數，PH值為7.0，按2%的接種量接種；
[0014](3)生長階段，在基礎料中生長3_5h，待培養基中的初始糖耗盡后，補50%葡萄糖溶液4-6h ；
[0015](4)誘導期，停止補葡萄糖，待葡萄糖耗盡，溶氧上升，PH回升后，添加終濃度為0.1mM-0.8mM的IPTG。通過50%葡萄糖溶液的間歇流加來控制pH值穩定在7.0左右。
[0016](5)發酵過程中，工藝參數的控制為:pH值為6.5-7.5，溶氧值為不小于20%，生長期溫度和誘導期溫度為37°C。
[0017]本發明使用的發酵罐為NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC C0.公司生產的B1FlollO型發酵罐。本發明提供的發酵生產重組kfpase的工藝，適用于市場上出售的任何廠家生產的發酵罐。
[0018]離心發酵液收集菌泥，超聲破碎，進行產物的檢測，結果如圖1所示，經過SDS-PAGE法檢測，重組kfpase蛋白表達量達到總蛋白30%以上。
【附圖說明】
[0019]附圖重組牛虻抗血栓酶發酵過程不同時間取樣電泳圖(1:誘導前樣品2:誘導I小時樣品3:誘導2小時樣品4:誘導3小時樣品5:誘導4小時樣品)
【具體實施方式】
[0020]實施例1工程菌株的構建
[0021]利用常規的DNA重組技術將kfpase基因正確置于大腸桿菌表達載體pet30a,轉化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)，經篩選建立分泌表達kfpase的工程菌株。
[0022]實施例2工程菌株的活化
[0023](I)平板培養基的組成:含1%的蛋白胨，0.5%的酵母粉，1%的氯化鈉，2%的瓊月旨，40ug/ml卡那霉素。
[0024](2)凍存的甘油管菌株，挑取少許涂入上述的培養基中，37°C培養14_16h，待長出大小適宜的單菌落，取出4°C保存。
[0025]實施例3 —級種子的制備
[0026](I)培養基的組成:1%的蛋白胨，0.5%的酵母粉，1%的氯化鈉，40ug/ml卡那霉素。
[0027](2)挑取平板種子接種上述的三角瓶培養基，37°C，200rpm，培養811。00600為2.0。
[0028]實施例4 二級種子的制備
[0029](I)培養基的組成:1%的蛋白胨，0.5%的酵母粉，1%的氯化鈉，40ug/ml卡那霉素。
[0030](2) 一級種子，以I %的接種量接種制備二級種子，370C，200rpm,培養15h。0D600為 4.0。
[0031]實施例5上罐培養
[0032](I) 4.5L發酵培養基組成
[0033]稱取glucose22.5g, yeast extract49.5g, tryptone85.5g, MgS044.5g,KH2PO413.5g, K2HPO4.3H2081g, (NH4) 2S0418g，溶于 4L 水中，定容 4.5L。
[0034](2)待發酵罐滅菌，降溫至37°C，調整PH值為7.0，罐上的控制參數調整好后，按2%的接種量接種。
[0035](3)生長階段
[0036]接種后，前2h為適應期，在次過程中，發酵參數變化不明顯，pH值慢慢降低，低于7.0時通過自動流加30%氨水來控制pH值在7.0左右；2小時后溶氧開始快速下降，當溶氧值低于20%時，通過攪拌的提升和通空氣量的增加，來滿足需求，必要時通純氧以維持20%的溶氧值。在基礎料中生長4h左右，培養基中的初始糖消耗完，溶氧快速上升，pH值明顯回升，指數流加50%葡萄糖溶液約5h。
[0037](4)誘導期
[0038]停止補葡萄糖，待溶氧上升，PH回升后，添加IPTG至終濃度為0.5mM。誘導重組牛虻抗血栓酶表達時通過緩慢間歇式流加50%葡萄糖溶液來調節pH值在7.0左右。
[0039](5)離心發酵液，收集菌泥，用于純化。
[0040]實施例6檢測結果及結論
[0041]取適量菌泥，使用pH8.020mM Tris-HCl重懸后超聲破碎，經過SDS-PAGE法檢測，如圖1重組牛虻抗血栓酶發酵過程不同時間取樣電泳圖所示，重組牛虻抗血栓酶蛋白表達量在誘導3h后就達到高峰，且重組牛虻抗血栓酶占總蛋白表達量的30%以上。
【主權項】
1.一種發酵生產牛虻抗血栓酶的方法，包括:(1)構建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表達工程菌株，(2) —級種子的培養，(3) 二級種子的培養，(4)上罐發酵，(5)離心發酵液收集菌泥，進行純化，其特征在于，在上罐發酵過程中，參數設置為PH值為6.5-7.5，溶氧值為不小于20%，生長溫度為30°C _37°C，誘導期溫度為25°C _37°C。
2.如權利要求1所述的發酵生產牛虻抗血栓酶的方法,其中，將kfpase基因正確置于大腸桿菌表達載體pet30a，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，經篩選建立分泌表達kfpase的工程菌株。
3.如權利要求1所述的發酵生產牛虻抗血栓酶的方法，其中，一級種子的制備，挑取平板種子接種到三角瓶培養基，培養基為LB，37°C，200rpm，培養7_9h，0D600為1-2。
4.如權利要求1所述的發酵生產牛虻抗血栓酶的方法，其中，二級種子的制備，以1%接種量接種三角瓶培養基，培養基為LB，37°C，200rpm，培養14_18h，0D600為3-5。
5.如權利要求1所述的發酵生產重組牛虻抗血栓酶的方法，其中，上罐發酵過程中: (1)4.5發酵培養基組成稱取 glucose22.5g, yeast extract49.5g, tryptone85.5g, MgS044.5g, KH2PO413.5g,K2HPO4.3H2081g，(NH4)2S0418g，溶于 4L 水中，定容 4.5L ； (2)待發酵罐滅菌，降溫至37°C，調整參數，PH值為7.0，按2%的接種量接種； (3)生長階段，在基礎料中生長3-5h，待培養基中的初始糖耗盡后，補50%葡萄糖溶液4_6h ； (4)誘導期，停止補葡萄糖，待葡萄糖耗盡，溶氧上升，PH回升后，添加終濃度為0.1mM-0.8mM的IPTG。通過50%葡萄糖溶液的間歇流加來控制pH值穩定在7.0左右； (5)發酵過程中，工藝參數的控制為:pH值為6.5-7.5，溶氧值為不小于20%，生長期溫度和誘導期溫度為37°C。
6.如權利要求1所述的發酵生產重組牛虻抗血栓酶的方法，其中，將發酵液離心，收集菌泥，進行純化。
【專利摘要】本發明屬于生物發酵領域，提供了一種發酵生產重組牛虻抗血栓酶的方法。此法包括：(1)構建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表達工程菌株，(2)一級種子的培養，(3)二級種子的培養，(4)上罐發酵，(5)離心發酵液收集菌泥，進行純化。通過本發明提供的發酵方法，能使重組牛虻抗血栓酶獲得高效表達。
【IPC分類】C12R1-19, C12N9-68
【公開號】CN104630191
【申請號】CN201310560274
【發明人】秦引林, 莊韜
【申請人】江蘇柯菲平醫藥股份有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月12日