β-1,3-1,4葡聚糖酶的高效廉價生產方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種以碎囊毛霉為菌種固體發酵制備β-1，3-1，4葡聚糖酶的方法。
【背景技術】
[0002]β -1, 3-1, 4 葡聚糖酶(β -1，3-1, 4-Dextranase)是一種內切酶，專一作用于β-葡聚糖的1，3及1，4糖苷鍵，產生3 - 5個葡萄糖單位的低聚糖及葡萄糖；該產品可以有效分解麥類和谷類植物胚乳細胞壁中的β_葡聚糖，在飼料中可用于降低非淀粉多糖(NSP )及其抗營養因子的含量，改善畜禽對營養物質的吸收，提高畜禽的生長速度和飼料轉化效率；在啤酒釀造上用于降低麥汁黏度，改善過濾性能，提高麥芽溶出率，防止啤酒渾濁，穩定啤酒質量。在食品工業及其他工業中可以分解部分纖維素，降低纖維素含量及果膠粘度，可以改善食品質構及工業產品品質；β_葡聚糖酶是通過BacillusLichenifomis (地衣芽孢桿菌菌株)經過液態深層發酵制得；本發明引進的碎囊毛霉菌株(Mucor petrinsularis),具有營養要求低、繁殖快、發酵產物易于提取分離、發酵周期短和產酶能力強等優點，適合大規模工業化生產。紅色，澄清透明，酸爽適中，獨具特有的草莓風味。不僅營養豐富，還可抗氧化、防癌抗癌。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種以麩皮和大麥為原料制備β_葡聚糖酶的方法；本發明以中科院菌種資源碎囊毛霉(編號:3.03441)為菌種，采用固體發酵的方法，有效縮短了發酵周期。另外本發明以麩皮、大麥為原料進行固態發酵，不添加任何其它成分，極大地降低了成本；同時有效緩解了葡聚糖酶市場供應不足的問題，工藝簡單，便于進行工業化推廣；本發明的目的是按如下技術方案實現的，其特征是它包括以下步驟:
(1)產酶培養
本發明以中國普通微生物菌種保藏管理中心的將碎囊毛霉菌種(ATCC編號3.03441)接種于制備好的PDA斜面上，28°C培養48?72h，待孢子成熟即可使用；向培養成熟的試管斜面中注入5mL無菌生理鹽水，用接種環或無菌玻棒攪動，刮下碎囊毛霉孢子，振蕩均勻并稀釋至14個/mL，得到孢子懸液；將麩皮和大麥以1:2比例混合，按50 %(ff/V)加入自來水，121°C滅菌10 min，得到固體發酵培養基；將孢子懸液按5%(V/W)接入液體發酵培養基中，26°C培養96h，得到發酵底物；
(2)粗酶制備
向發酵底物以1:1比例加入pH值5.5的HAc-NaAc緩沖液100 ml,移入振蕩器中200r/min振蕩30分鐘,6559Xg離心1min,收取上清；最終所得粗酶酶活力9.041 U/ml,蛋白質含量為0.140 mg,比活酶為64.583U/mg ；
(3)酶的精制
粗酶液經飽和度80%的硫酸銨鹽析,透析24h濃縮處理,再經Sephadex G-100 (葡聚糖凝膠G-100)柱凝膠過濾后，截取吸光值(0D=280nm)為280nm的組分；得到了電泳純酶，比酶活達到225.02U/mg，純度較粗酶樣提高了 3.48倍；
(4)酶的常數
在40-50°C時相對穩定，最適反應溫度為55°C ;酶活力在pH值4.5-5.5條件下相對穩定，最適pH值為5.5 ;Fe3+和Al3+對其有抑制作用，Fe2+對其有激活作用，其他金屬離子對其影響不大；低濃度的尿素對該酶影響不大但高濃度的尿素對其有抑制作用，其他化合物如疏基乙醇及SDS對該酶均有抑制作用；經檢測該酶的最佳反應時間為1min ；
本發明的有益效果
(1)工藝簡單，發酵周期短，適于工業化推廣；
(2)以麩皮和大麥為原料固體發酵生產葡聚糖酶,生產成本極低；
(3)采用碎囊毛霉菌種進行發酵，得到β-葡聚糖酶活力高；
【具體實施方式】下面的實施例可以進一步說明本發明，但不以任何方式限制本發明:
實施例1
將碎囊毛霉菌株接種于制備好的PDA斜面上，28°C培養72h，待孢子成熟即可使用；向培養成熟的試管斜面中注入5mL無菌生理鹽水，用接種環或無菌玻棒攪動，刮下碎囊毛霉孢子，振蕩均勻并稀釋至14個/mL，得到孢子懸液；將麩皮:大麥=1:2比例混合，按50 %(ff/V)加入自來水，121°C滅菌10 min，得到固體發酵培養基；將孢子懸液按5%(V/V)接入發酵培養基中，26°C靜置培養96h，得到發酵物；將發酵物以1:1(W/V)比例加入pH值5.5的HAc-NaAc緩沖液，移入振蕩器中200 r/min振蕩30分鐘,6559 X g離心1min,收取上清，為粗酶；粗酶液經飽和度80%的硫酸銨鹽析，透析24h濃縮處理，再經S印hadex G-100 (葡聚糖凝膠G-100)柱凝膠過濾后，截取吸光值(0D=280nm)為280nm的組分，即為電泳純酶；
實施例2
將碎囊毛霉菌株接種于制備好的PDA斜面上，20-30°C培養24-72h，待孢子成熟即可使用；向培養成熟的試管斜面中注入5-100mL無菌生理鹽水，用接種環或無菌玻棒攪動，刮下碎囊毛霉孢子，振蕩均勻并稀釋至14-1O8個/mL，得到孢子懸液；將麩皮:大麥=1:1-1: 10比例混合，按20 %-200%(ff/V)加入自來水，121°C滅菌10-30 min，得到固體發酵培養基；將孢子懸液按1%_10%(V/V)接入發酵培養基中，20-30°C靜置培養24-96h，得到發酵物；將發酵物以1:1-1:10 (W/V)比例比例加入pH值5.5的HAc-NaAc緩沖液若干ml，移入振蕩器中200 r/min振蕩10-60分鐘，3000-10000 X g離心5_100min，收取上清，為粗酶。粗酶液經飽和度60-90%的硫酸銨鹽析,透析5_24h濃縮處理,再經Sephadex G-100 (葡聚糖凝膠G-100)柱凝膠過濾后，截取吸光值(0D=280nm)為280nm的組分，即為電泳純酶；
實施例3
將碎囊毛霉菌株接種于制備好的PDA斜面上，20-30°C培養24-72h，待孢子成熟即可使用；向培養成熟的試管斜面中注入5-100mL無菌生理鹽水，用接種環或無菌玻棒攪動，刮下碎囊毛霉孢子，振蕩均勻并稀釋至14-1O8個/mL，得到孢子懸液；將麩皮:大麥=1:1-1: 10比例混合，按200%-1000%(W/V)加入自來水，121°C滅菌10-30 min,得到液體發酵培養基；將孢子懸液按1%_10%(V/V)接入發酵培養基中，20-30°C靜置培養24-96h，得到發酵物；將發酵物以1:1-1:10 (W/V)比例比例加入pH值5.5的HAc-NaAc緩沖液若干ml,移入振蕩器中200 r/min振蕩10-60分鐘，3000-10000 X g離心5_100min，收取上清，為粗酶；粗酶液經飽和度60-90%的硫酸銨鹽析,透析5_24h濃縮處理,再經Sephadex G-100 (葡聚糖凝膠G-100)柱凝膠過濾后，截取吸光值(0D=280nm)為280nm的組分，即為電泳純酶。
【主權項】
1.β -1, 3-1，4葡聚糖酶的高效廉價生產方法，其特征在于步驟如下: (1)產酶培養 將碎囊毛霉菌種(ATCC編號3.03441)接種于制備好的PDA斜面上，28°C培養48?72h，待孢子成熟即可使用；向培養成熟的試管斜面中注入5mL無菌生理鹽水，用接種環或無菌玻棒攪動，刮下碎囊毛霉孢子，振蕩均勻并稀釋至14個/mL，得到孢子懸液；將麩皮和大麥以1:2比例混合，按50 %(ff/V)加入自來水，121°C滅菌10 min，得到固體發酵培養基；將孢子懸液按5%(V/W)接入液體發酵培養基中，26°C培養96h，得到發酵底物； (2)粗酶制備 向發酵底物以1:1比例加入pH值5.5的HAc-NaAc緩沖液100 ml,移入振蕩器中200r/min振蕩30分鐘,6559 Xg離心1min,收取上清； (3)酶的精制 粗酶液經飽和度80%的硫酸銨鹽析,透析24h濃縮處理,再經Sephadex G-100 (葡聚糖凝膠G-100)柱凝膠過濾后，截取吸光值(0D=280nm)為280nm的組分；得到了電泳純酶，比酶活達到225.02U/mg。
【專利摘要】本發明公開了β-1,3-1,4葡聚糖酶的高效廉價生產方法，包括碎囊毛霉產酶培養、粗酶制備、酶的精制以及精制酶的酶活力及基本常數；本發明具有成本低、繁殖快、發酵產物易于提取分離、發酵周期短和產酶能力強等優點，適合大規模工業化生產。3.0344120021002
【IPC分類】C12R1-785, C12N9-24
【公開號】CN104630179
【申請號】CN201310541840
【發明人】艾對元, 張衛兵, 贠建民
【申請人】甘肅農業大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月6日