抗Cry1Ab毒素納米抗體、其編碼序列及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品科學或食品生物技術領域，涉及一種針對于CrylAb毒素的納米抗體、其編碼序列及應用。
【背景技術】
[0002]Bt毒素作為一類由蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensi,簡稱Bt)產生的殺蟲晶體蛋白，近年來已廣為人知。由于其對鱗翅目和鞘翅目的一些害蟲具有高效、特異的毒殺作用，目前Bt毒素已作為微生物殺蟲劑廣泛應用于害蟲的防治或表達于轉基因植物中。其中Cry毒素是應用最廣泛的Bt蛋白，比如CrylAb和CrylAc。然而自從幾十年前第一個商品化Bt產品問世以來，人們對轉基因植物的安全性和局限性愈加關注和擔憂。有報道指出，轉基因植物的某些營養特性已有所改變；其它研究證明，Cry毒素會在小鼠體內引起血液毒性。Cry毒素廣闊的應用前景及其對人類健康的潛在風險和對生態環境的長期影響將會引起公眾的的持續關注。
[0003]目前，轉基因植物及其產品的檢測大部分是基于核酸和蛋白質水平。核酸水平檢測遺傳物質中是否含有插入的外源毒素基因，如PCR、定量PCR等；蛋白質水平利用插入外源毒素基因表達的蛋白質產物或其功能進行檢測，如酶聯免疫檢測法、Western blot法、試紙條法等。在轉基因植物檢測中，采用酶聯免疫檢測技術(ELISA)檢測Cry毒素是目前公認的一種具有明顯優勢的技術，它具有快速、準確、靈敏度高、能大量檢測樣本等優點。然而，要獲取具有強親和力、高特異性的Cry毒素抗體(單克隆、多克隆、單鏈抗體)卻是一項困難的工作。
[0004]單域抗體，也叫納米抗體(VHH)，是由約120個氨基酸組成的肽段，是目前已知的最小的天然抗體片段，能識別目的抗原上常規抗體不能識別的某些位點，并且具有熱穩定性高、表達量高、親和力強、特異性好、生產周期短等特點。其分子結構只含有一個重鏈可變區(VHH)和兩個常規的CH2和CH3區，但相比于人工改造的單鏈抗體片段(scFv)，其克服了相互粘連、甚至聚集成塊的缺點。更重要的是，單獨克隆并表達出來的VHH結構具備與原重鏈抗體相當的結構穩定性以及抗原結合活性，是目前已知的可結合目標抗原的最小單位。隨著生物工程技術的發展，納米抗體已開始被廣泛應用于檢測、分析、治療等領域，彌補了其它種類抗體的不足之處。比如基于納米抗體技術檢測人體前白蛋白、載脂蛋白B的研究等。因此應用納米抗體技術研發CrylAb檢測試劑具有廣闊的前景。
【發明內容】
[0005]發明目的:本發明所要解決的技術問題是提供一種針對CrylAb表位的納米抗體，同時提供該納米抗體的編碼序列。
[0006]技術方案:為實現上述目的，本發明的第一方面，提供了一種CrylAb的納米抗體的VHH鏈，包括框架區FR和互補決定區⑶R，所述框架區FR選自下組的FR的氨基酸序列:SEQ ID NO:1 所示的 FRl，SEQ ID NO:2 所示的 FR2，SEQ ID NO:3 所示的 FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4 ;所述互補決定區⑶R選自下組的⑶R的氨基酸序列:SEQ ID N0:5所示的⑶R1，SEQ ID NO:6 所示的 CDR2，SEQ ID NO:7 所示的 CDR3。
[0007]優選地，所述的CrylAb的納米抗體的VHH鏈，它具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0008]本發明第二方面，一種CrylAb納米抗體,它針對CrylAb表位的納米抗體,包括兩條具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VHH鏈。
[0009]本發明第三方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質:本發明所述的CrylAb的納米抗體的VHH鏈,或本發明所述的CrylAb納米抗體。
[0010]優選地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列:
SEQ ID NO:8o
本發明的第四方面，提供了一種表達載體，它含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0011]本發明的第五方面，提供了一種宿主細胞，其特征在于，它含有所述的表達載體。
[0012]本發明的第六方面，提供了本發明所述的CrylAb納米抗體檢測CrylAb分子的用途。
[0013]有益效果:與現有技術相比，本發明的優點如下:本發明首先將CrylAb毒素分子偶聯在酶標板上，展示該蛋白的正確空間結構，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術篩選免疫納米抗體基因庫(駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫)，從而獲得了 CrylAb特異性的納米抗體基因，將此基因轉至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。
【附圖說明】
[0014]圖1是納米抗體的DNA電泳圖，從左到右凝膠孔的DNA條帶分別是:第一道為100bp的分子標記，其余孔道為PCR產物，PCR產物帶約為500bp ；
圖2是CrylAb納米抗體，經鎳柱樹脂凝膠親和層析純化后的SDS-PAGE的電泳圖，結果顯示，CrylAb納米抗體經過該純化過程,其純度可達到95%以上。
【具體實施方式】
[0015]本發明應用針對CrylAb偶聯在酶標板上，展示蛋白質的正確空間結構，以此形式的抗原篩選免疫納米抗體基因庫(駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫)，而獲得了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。
[0016]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0017]實施例1:針對于CrylAb的納米抗體文庫的構建:
(I)首先獲得CrylAb蛋白(購自上海佑隆生物科技有限公司)，將I mg CrylAb與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只單峰駝，每周一次，共免疫6次，刺激B細胞表達抗原特異性的納米抗體；(2) 6次免疫結束后，提取100 mL駱駝外周血淋巴細胞并提取總RNA ; (3)合成cDNA(利用 Superscript reverse transcriptase CAT: 18064-014 合成)并利用巢式 PCR擴增VHH，第一步PCR具體步驟為:94 ° C 7 min I個循環、94 ° C I min 30個循環、55° CI min,72° C I min,72° C 10 min,第二步PCR具體步驟同第一步PCR，只是循環次數由30次降至17次；(4)利用限制性內切酶PstI及NotI酶切20 μ g pComb3噬菌體展示載體(B1vector供應)及10 μ g VHH并連接兩個片段；(5)將連接產物轉化至電轉感受態細胞TGl中，構建CrylAb納米抗體文庫并測定庫容，庫容大小為2X109。
[0018]實施例2:針對CrylAb的納米抗體篩選過程:
(I)將溶解在100 mM NaHC03> pH 8.2中的20 μ g CrylAb偶聯在NUNC酶標板上，
4 °C放置過夜；(2)第二天加入100 UL 0.1%酪蛋白，室溫封閉2 h ；(3)2 h后，力口Λ100 μ L噬菌體(5Χ 10ntfu免疫駱駝納米抗體噬菌展示基因庫，具體獲得過程見實施例1)，室溫作用I h; (4)用0.05% PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉不結合的噬菌體；(5)用100mM TEA (triethylamine)將與CrylAb特異性結合的曬菌體解離下,并感染處于對數期生長的大腸桿菌TGl, 37 °C培養I h,產生并純化曬菌體用于下一輪的篩選,相同篩選過程重復3-4輪,逐步得到富集。
[0019]實施例3:用噬菌體的酶聯免疫方法(ELISA)篩選特異性單個陽性克隆:
(I)從上述實施例2中3-4輪篩選后含有噬菌體的細胞培養皿中，挑選96個單個菌落并接種于含有100μ g/mL的氨芐青霉素的TB培養基(ILTB培養基中含有2.3克磷酸二氫鉀，12.52克磷酸氫二鉀，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4mL甘油)中，生長至對數期后，加終濃度I毫摩爾的IPTG，28 °C培養過夜。(2)利用滲透法(Zhu，Μ.，Hu, Y., Li, G.,0u, ff., Mao, P., Xin, S., Wan, Y., 2014.Combining magnetic nanoparticle withb1tinylated nanobodies for rapid and sensitive detect1n of influenza H3N2.Nanoscale research letters 9(1)，528.P3_4)獲得粗提抗體,并將抗體轉移到經抗原包被的ELISA板中，在室溫下放置I小時。(3)用PBST洗去未結合的抗體，加入一 mouseant1-HA tag antibody (抗鼠抗HA抗體,購自北京康為世紀生物科技有限公司),在室溫下放置I小時。(4)用PBST洗去未結合的抗體，加入ant1-mouse alkaline phosphataseconjugate (山羊抗小鼠堿性磷酸酶標記抗體，購自艾美捷科技有限公司)，在室溫下放置I小時。(5)用PBST洗去未結合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于ELISA儀上，在405nm波長，讀取吸收值。(6)當樣品孔OD值大于對照孔OD值3倍以上時，判為陽性克隆孔。(7)將陽性克隆孔的菌轉搖在含有100微克每毫升的LB液體中以便提取質粒并進行測序。
根據序列比對軟件Vector NTI分析各個克隆株的基因序列，把⑶R1，⑶R2，⑶R3序列相同的株視為同一克隆株，而其序列不同的株視為不同克隆株，其抗體的VHH鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0020]實施例4:納米抗體在宿主菌大腸桿菌中表達、純化:
1.將前面測序分析所獲得不同克隆株的質粒電轉化到大腸桿菌WK6中，并將其涂布在LA+glucose即含有氨芐青霉素和葡萄糖的培養平板上，37 1:培養過夜；(2)挑選單個菌落接種在5 mL含有氨芐青霉素的LB培養液中，37 °C搖床培養過夜；(3)接種I mL的過夜菌種至330 mL TB培養液中，37 °C搖床培養，培養到OD值達到0.6~1時，加入IPTG，28。。搖床培養過夜；(4)離心，收菌；(5)利用滲透法，獲得抗體粗提液；(6)經鎳柱離子親和層析可制備純度達90%以上的蛋白。
[0021]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出:對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種針對CrylAb納米抗體的VHH鏈，包括框架區FR和互補決定區⑶R，其特征在于，所述框架區FR選自下組的FR的氨基酸序列:SEQ ID NO:1所示的FRl，SEQ ID NO:2所示的FR2，SEQ ID NO:3所示的FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4 ;所述互補決定區CDR選自下組的 CDR 的氨基酸序列:SEQ ID NO:5 所示的 CDRl，SEQ ID NO:6 所示的 CDR2，SEQ ID NO:7所示的CDR3。
2.根據權利要求1所述的CrylAb納米抗體的VHH鏈，其特征在于，它具有SEQID NO:8所示的核苷酸序列。
3.—種CrylAb納米抗體,其特征在于,它針對CrylAb表位的納米抗體,包括兩條具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VHH鏈。
4.一種DNA分子，其特征在于，它編碼選自下組的蛋白質:權利要求1或2所述的CrylAb納米抗體的VHH鏈,或權利要求3所述的CrylAb納米抗體。
5.根據權利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自DNA序列如SEQ ID NO:8 所示。
6.—種表達載體,其特征在于,它含SEQID NO:8所不的核苷酸序列。
7.一種宿主細胞，其特征在于，它可以表達CrylAb的納米抗體。
8.權利要求3所述的CrylAb納米抗體用于檢測CrylAb分子的用途。
9.一種用于檢測CrylAb分子的試劑盒,其包括權利要求3所述的CrylAb納米抗體。
【專利摘要】本發明公開了一種抗Cry1Ab納米抗體、其編碼序列、能夠表達該納米抗體的宿主細胞及該納米抗體的應用。本發明從噬菌體抗體庫中淘選獲得納米抗體（Nanobody），其特征在于此納米抗體的特異性是由其重鏈可變區序列中CDR區序列決定。該納米抗體能夠在大腸桿菌內高效表達，具有較大的利用價值。
【IPC分類】C12N15-63, C12N15-13, C07K16-12, G01N33-558
【公開號】CN104628852
【申請號】CN201510060091
【發明人】萬亞坤, 李敏, 朱敏
【申請人】東南大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月4日