利那洛肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及利那洛肽的制備方法。
【背景技術】
[0002] 利那洛肽是在成年中治療便秘腸易激綜合征（IBS-C)和慢性特發性便秘（CIC)的 藥物（鳥苷酸環化酶一 C(GC-C)的激動劑）。利那洛肽與腸道GC-C結合后，導致細胞內外 環鳥苷酸（cGMP)濃度升高。細胞內cGMP升高可以刺激腸液分泌，加快胃腸道移行，從而增 加排便頻率。細胞外cGMP濃度升高可以降低痛覺神經的靈敏度，可減低腸道疼痛。此外，利 那洛肽也可用于治療和預防結腸癌、直腸癌和機體炎癥。利那洛肽序列為SEQ ID N0 :1所示 的序列：CysCysGluTyrCysCysAsnProAlaCysThrGlyCysTy;r。在 1 位和 6 位、2 位和 10 位以及 5位和13位的半胱氨酸殘基之間通過氧化形成二硫鍵成環，到目前為止，利那洛肽及其相 關肽的合成制備僅得到10-25%的產物，例如文獻Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide, Published online4August2010in Wiley Online Library,報道的制備方法。中國專利公開號CN102875655A，其氧化步驟進一步簡 化，產率也有所提高，但是其收率仍然不理想，環化過程復雜且環化產率低，需要消耗大量 的溶劑和原料，且需要大量的時間分離提純，給工業化生產帶來不便。
【發明內容】
[0003] 為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種利那洛肽的制備方法，簡化環化 過程，提升環化廣率，使廣品收率提商。
[0004] 本發明的技術方案是：具有如下結構的利那洛肽的制備方法，
【主權項】
1. 具有如下結構的利那洛肽的制備方法，
其特征在于：包括如下步驟： (1) 采用固相Fmoc技術，將羧基樹脂和側連帶有保護基的Fmoc酪氨酸置于反應瓶中， 加入有機堿和偶合劑，在DMF溶液中反應后，脫除Fmoc保護基團，得到與側連帶有保護基的 酪氨酸偶聯的樹脂； (2) 將步驟（1)得到的與側連帶有保護基的酪氨酸偶聯的樹脂直接和側連帶有保護基 的Fmoc半胱氨酸置于反應瓶中,加入有機堿及偶合劑,在DMF溶液中反應后，脫除Fmoc保 護基團，得到進一步與側連帶有保護基的半胱氨酸偶聯的樹脂； (3) 依次重復步驟（2)，其中原料氨基酸依次替換為Fmoc甘氨酸、側連帶有保護基的 Fmoc蘇氨酸、側連帶有保護基的Fmoc半胱氨酸、Fmoc丙氨酸、Fmoc脯氨酸、側連帶有保護 基的Fmoc天冬酰胺、側連帶有保護基的Fmoc半胱氨酸、側連帶有保護基的Fmoc半胱氨酸、 側連帶有保護基的Fmoc蘇氨酸、側連帶有保護基的Fmoc谷氨酸、側連帶有保護基的Fmoc 半胱氨酸、側連帶有保護基的Fmoc半胱氨酸，最終得到脫除Fmoc保護基團、且與上述氨基 酸依次偶聯的樹脂； (4) 切割步驟（3)所得與上述氨基酸依次偶聯的樹脂，得到化合物： H〇-Tyr-Cys-Gly-Thr-Cys-Ala-Pr〇-Asn-Cys-Cys - Tyr-Glu-Cys-Cys-H ； (5) 將步驟（4)所得化合物用單質碘在pH=6-13的磷酸鈉緩沖溶液中氧化，形成三個 二硫鍵得到利那洛肽產品：
2. 根據權利要求1所述的利那洛肽的制備方法，其特征在于，所述側連帶有保護基的 Fmoc酪氨酸、側連帶有保護基的Fmoc半胱氨酸、側連帶有保護基的Fmoc蘇氨酸、側連帶有 保護基的Fmoc天冬酰胺、側連帶有保護基的Fmoc谷氨酸依次為叔丁基保護的Fmoc酪氨 酸、三苯甲基保護的Fmoc半胱氨酸、Trt保護的Fmoc蘇氨酸、Trt保護的Fmoc天冬酰胺、 tBu保護的Fmoc谷氨酸。
3. 根據權利要求1所述的利那洛肽的制備方法，其特征在于，所述羧基樹脂為王樹脂； 所述有機堿為二異丙基乙基氨；所述偶合劑為苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸 鹽。
4. 根據權利要求1所述的利那洛肽的制備方法，其特征在于，所述各種側連帶有保護 基的Fmoc氨基酸與羧基樹脂的摩爾比均為2~8/1。
5. 根據權利要求1所述的利那洛肽的制備方法，其特征在于，所述偶合劑與羧基樹脂 摩爾比2~8/1。
6. 根據權利要求1所述的利那洛肽的制備方法，其特征在于，所述堿與各種側連帶有 保護基的Fmoc氨基酸摩爾比均為2~6/1。
7. 根據權利要求1所述的利那洛肽的制備方法，其特征在于，所述脫除Fmoc保護基團 的體系是六氫哌啶/DMF混合液；所述六氫哌啶/DMF混合液的體積比1/4,所述六氫哌啶/ DMF混合液加入量為10-30mL/g樹脂。
8. 根據權利要求1所述的利那洛肽的制備方法，其特征在于，所述步驟（5)中磷酸鈉緩 沖溶液中單質碘的含量2-15%。
9. 根據權利要求1所述的利那洛肽的制備方法，其特征在于，所述步驟（5)中氧化的時 間為6-12h，氧化的溫度為15-30°C。
10. 根據權利要求1所述的利那洛肽的制備方法，其特征在于，所述氧化二硫鍵反應位 置發生在按N端到C端的順序：1位和6位、5位和13位、2位和10位半胱氨酸雙硫鍵。
【專利摘要】本發明提供利那洛肽的制備方法，利用標準的Fmoc技術，將側鏈保護的氨基酸與WANG樹脂相連，加入縮合劑HBTU和堿DIPEA，在DMF溶劑中發生縮合反應，采用含20%六氫哌啶的DMF溶液進行脫Fmoc保護,然后從固相樹脂上切下來。在磷酸鈉緩沖溶液中加入碘單質進行氧化Cysteine，獲得利那洛肽。本發明提供的利那洛肽的制備方法是高產率的合成利那洛肽的工藝，簡化了環化過程，提升了環化產率，最終產品收率達到30%-60%；該制備方法簡便、反應條件溫和、收率較高、得到產品純度高，是利那洛肽產業化可行的制備方法，為工業生產提供了良好的前景。
【IPC分類】C07K1-04, C07K7-08, C07K1-06
【公開號】CN104628826
【申請號】CN201310556661
【發明人】吳君臣, 劉奔, 鄒榮峰, 王 琦, 田禾
【申請人】華東理工大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月11日