修飾目的基因表達的組合物和方法
【專利說明】修飾目的基因表達的組合物和方法發明領域
[0001]本發明涉及生物技術領域。更具體地，本發明涉及用于在果實胚乳中表達目的基因的特定啟動子。本發明進一步描述含有與異源和/或內源基因可操作連接的本發明啟動子的DNA構建體。此外，本發明涉及這些構建體以表達載體，重組載體形式的使用和在植物，植物細胞或轉基因原生質體中的使用。本發明進一步描述使用這種含有本發明啟動子的構建體產生植物，植物細胞或轉基因原生質體的方法。因此，僅在目的部分表達轉基因使得能夠僅在果實中積累外源轉錄物，這有利于實現一些策略，這些策略目的在于除了具有高營養價值和高治療價值的植物之外，還在于增加附加值，產生更適應環境脅迫，病原體和害蟲，農業防御措施的品種。除了這些優點，本發明還是植物體中表達系統的新的替代，并可用于產生新的品種和改良方案。本發明的目的在于增加與轉基因轉化相關的經濟，社會，環境和生物安全性利益。
_2] 發明背景
在過去的三十年,農業得益于與重組DNA技術相關的生物技術，植物組織的培養和用于產生除了具有更高營養價值(Aluru，M., Xu, Y., Guo, R., Wang, Z., Li, S.,White, W.， Wang, K.& Rodermelj S.2008 Generat1n of transgenic maize withenhanced provitamin A content.J.Exp.Bot.，v.59，n.3，p.3551 - 3562)和更高治療價值(Marcondes，J.& Hansen, E.2008 Transgenic lettuce seedlingscarrying hepatitis B virus antigen HBsAg.Braz.J.1nfect.Dis.，v.12，n.6，p.469-471)的植物之外，還有對除草劑有更強抗性的(Arag&o，F.J.L.，ViannajG.R., Albino, Μ.M.C.& Rechj Ε.L.2002 Transgenic Dry Bean Tolerant to theHerbicide Glufosinate Ammonium.Crop Science, v.42， n.4， p.1298-1302)，對昆蟲害蟲(insetos-praga)有更強抗性的(Lilley C.J.，Wang D.，Atkinson H.J.& Urwin P.E.2010 Effective delivery of a nematode-repellent peptide using.Plant B1technology Journal, pp.1-11 do1: 10.1111/j.1467-7652.2010.00542.x，a root-cap-specific promoter)和耐旱的(tolerant do drought) (Quan R，Hu S，Zhang Zj Zhang H， Zhang Z， Huang R.0verexpress1n of an ERF transcript1nfactor TSRFl improves rice drought tolerance.Plant B1technol J.2010 May1:8(4):476-88)的植物的經典改良方法。綜合起來，這些特性導致生產增加，經濟收益，種群質量的提高和環境的保護。通過轉基因技術，能夠引入目的基因，而不管其種間屏障。
[0003]盡管基因轉化存在相關的經濟，社會和環境利益，由于生物安全性問題，這種技術已成為在消費者和環保主義者一邊的關注對象。
[0004]來自于文獻的數據根據各代轉基因的出現指明了基因轉化應用的進展。第一和第二代的轉基因植物使用組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV 35S) (Odell,J.T., Nagy, F.& Chuaj N-H.1985 Identificat1n of DNA sequences required forthe activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter.Nature, v.313，p.810-812)，在根癌農桿菌(命tumefaciens)的T-DNA中發現的基因啟動子，例如歐烏頭堿合成酶(nepaline sintase)基因啟動子(Bevan，Μ.W.，Barnes, W.Μ.& Chilton, M.D.1983 Structure and transcript1n of the nopaline syntasegene reg1n of T-DNA.Nucleic Acids Research, v.11，n.2，p.369-385)和編碼高度保守的并且在幾乎所有生物體的生命過程中涉及的蛋白如泛素(Toki S.，TakamatsuS.，Nojiri C.，Ooba S.，Anzai H.，Iwata Μ.，Christensen A.Η.，Quail P.H.&Uchimiya H.1992 Express1n of a Maize Ubiquitin Gene Promoter—bar ChimericGene in Transgenic Rice Plants.Plant Phys1l.Nov; 100 (3): 1503-7)和肌動蛋白(An Y.Q., McDowell J.Μ.，Huang S., McKinney E.C., Chambliss S.& MeagherR.B.1996 Strong, constitutive express1n of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actinsubclass in vegetative tissues.Plant J.Jul; 10 (I): 107-21)的基因的啟動子。但是，第三代轉基因植物的特征在于，尤其是使用組織特異性啟動子如表皮細胞特異性啟動子(Hooker T.S., Millar A.A.& Kunst L 2002.Significance of the express1n ofthe CER6 condensing enzyme for cuticular wax product1n in Arabidop si s.PlantPhys1l.Aug; 129 (4): 1568-80)，韌皮部(of phoem)特異性啟動子(Okumoto S.，KochI , Tegeder M., Fischer W.N., Biehl A., Leister D., Stierhof Y.D.& FrommerW.B.2004.Root phloem-specific express1n of the plasma membrane amino acidproton co-transporter AAP3.J Exp Bot.0ct; 55 (406): 2155-68)，花粉(de polen)特異性啟動子(Wakeley PR，Rogers HJj Rozycka M，Greenland AJj Hussey PJ.A maizepectin methylesterase-1ike gene, ZmC5， specifically expressed in pollen.PlantMol B1l.1998 May; 37 (I): 187-92)或脅迫誘導型啟動子(Himmelbach Α.，Liu L，Zierold U.，Altschmied L，Maucher H.，Beier F.，Miiller D.，Hensel G.，HeiseA.，Schiitzendiibel A.，Kumlehn J.& Schweizer P.2010.Promoters of the barleygermin—like GER4 gene cluster enable strong transgene express1n in responseto pathogen attack.Plant Cell.2010.Mar; 22 (3):937-52.Epub Mar 19)，非生物脅迫誘導型啟動子(Rai Μ.，He C.& Wu R.2009.Comparative funct1nal analysisof three ab1tic stress—inducible promoters in transgenic rice.TransgenicRes.0ct; 18 (5): 787-99)和化學誘導型啟動子(Tomsett，A.Tregovaj A.Garoosi andM.Caddickj Ethano1-1nducibIe gene express1n: first step towards a new greenrevolut1n?, Trends Plant Sc1.9 (2004)，pp.159 - 161)以促進精確轉基因的表達并僅在需要時表達。
[0005]獲得并制造能夠在時間和/或空間上限制基因表達的可用的啟動子可以是平衡轉基因的利益和其限制的一條途徑。
[0006]啟動子是一套轉錄控制組件，位于酶聚合酶II的酶起始位點附近(Potenza，C.; Aleman, L.& Sengupta-Gopalanj C.2004.Targeting transgene express1nin research, agricultural, and environmental applicat1ns: Promoters used inplant transformat1n.1n Vitro Cellular Development B11gical-Plant v.40，p.1 -22)，其含有被轉錄相關蛋白識別的特定序列。基于其表達模式，不同類別的啟動子已在文獻中被描述。其中組成型啟動子在所有組織中以及在生物體發育的所有階段都具有活性，例如 CaMV35S (Odell, J.Τ.，Nagy, F.& Chuaj N-H.1985.1dentificat1nof DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus35S promoter.Nature, v.313，p.810-812)。另一方面，組織/器官特異性啟動子僅促進其相關基因在其組織/器官革G標中如果實(Atkinson R.G.，Bolitho K.Μ.，WrightM.A., Iturriagagoitia-Bueno Τ., Reid S.J.& Ross G.S.1998 Apple ACC-oxidaseand polygalacturonase: ripening—specific gene express1n and promoteranalysis in transgenic tomat0.Plant Mol B1l.0ct; 38 (3):449-60)、谷物種子(Paine J.A.，Shipton C.A.，Chaggar S.，Howells R.M.，Kennedy M.J.，Vernon G.，Wright S.Y., Hinchliffe E., Adams J.L., Silverstone A.L.& Drake R.2005.1mproving the nutrit1nal value of Golden Rice through increased pro-vitamin Acontent.Nat B1technol.Apr; 23 (4): 482-7)、根 / 小塊莖(Visser R.G.，Stolte A.&Jacobsen E.1991.Express1n of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUSgene in transgenic potato plants.Plant Mol B1l.0ct;17(4):691-9)、 花(Annadana S., Beekwilder M.J., Kuipers G., Visser P.B., Outchkourov N.,Pereira A., Udayakumar M., De Jong J.& Jongsma M.A.2002.Cloning of thechrysanthemum UEPl promoter and comparative express1n in florets and leavesof Dendranthema grandiflora.Transgenic Res.Aug; 11 (4):437-45)、 葉(NomuraM.，Katayama K.，Nishimura A.，Ishida Y.，Ohta S.，Komari T.，Miyao-TokutomiM.，Tajima S.& Matsuoka M.2000.The promoter of rbcS in a C3 plant (rice)directs organ-specific, light-dependent express1n in a C4 plant (maize),but does not confer bundle sheath cell-specific express1n.Plant Mol B1l.Sep;44(1):99-106)中表達。還有響應性或誘導型啟動子，其由確定的情況激活，對生物，非生物或化學脅迫做出響應。從給定生物體分離的啟動子可以用于通過嵌合基因構建體調節另一種生物體的基因。
[0007]對于植物來說，有無數組織特異性啟動子被描述，如在種子(W08903887)、小塊莖(如專利申請 US20030175783，Keil 等，1989 EMBO J.8: 1323:1330 中所提及的)、葉(如專利申請 US20030175783，Hudspeth 等，1989 Plant Mol B1l