藥物遞送蛋白質的增強運輸的突變體的分離的制作方法
【專利說明】藥物遞送蛋白質的増強運輸的突變體的分離
[0001]政府權利
[0002]本發明在國立衛生研宄院(Nat1nal Institutes of Health)頒發的資助編號CA129822和CA140995的政府支持下完成。政府具有本發明的某些權利。
技術領域
[0003]本發明提供了用于細胞滲透功能以改善藥物向特定細胞器的遞送的方法和組合物。
【背景技術】
[0004]定向進化已經被用于產生具有新趨性、減少的非特異性遞送以及免疫逃逸的假型腺聯病毒(AAV)衣殼(Kwon和Schaffer，2008 ；Maheshri等，2006)。不同選擇壓力下的體外和體內的噬菌體展示和全病毒文庫的生物淘選產生了具有期望特性的蛋白，比如具有增強的配體結合和攝入、免疫相互作用或酶活性(Yuan等，2005)。因此，對于用于產生具有改善特征的新蛋白質變體的合理突變來說，該方法可能是有力的和更有效的替代方案。該方法的最新開發的方式采用易錯PCR和交錯延伸來產生變體文庫，該變體文庫可針對不同的細胞類型進行篩選，以挑選出細胞特異性靶向的載體(Zhao等，1998)。迄今為止，尚未開發出分離具有增強的細胞內運輸功能的蛋白質變體的方法。本發明提出了一種新程序，以及從該程序產生的具有增強的用于藥物遞送的細胞滲透功能的新蛋白質分子。
【發明內容】
[0005]各種實施方式包括一種增強運輸至細胞的方法，包括:提供組合物，該組合物包括具有增強進入至細胞的一個或多個突變的五鄰體基質(PB)蛋白；以及將有效劑量的組合物施用至細胞。在一種實施方式中，一個或多個突變是IllC和/或333F。在另一實施方式中，組合物靶向至細胞的細胞質和/或細胞核。在另一實施方式中，組合物進一步包括治療性藥物。在另一實施方式中，細胞是腫瘤細胞。在另一實施方式中，一個或多個突變是SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12, SEQ IDNO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18, SEQID NO: 19 和 / 或 SEQ ID NO:20。
[0006]其他實施方式包括生產靶向至細胞器的藥物遞送分子的方法。該方法包括下述步驟:a)獲得編碼五鄰體基質(PB)基因的多核苷酸，并產生多核苷酸的突變體；b)將突變的多核苷酸克隆至噬菌體載體，并產生包括噬菌體載體的噬菌體文庫；c)用噬菌體文庫轉化細胞；d)分級分離前述轉化的細胞，并從轉化的細胞收獲細胞器；e)擴增來自前述收獲的細胞器的噬菌體；f)用擴增后的來自前述收獲的細胞器的噬菌體轉化細胞；g)重復步驟(d)、(e)、⑴和(g) ;h)滴定來自每輪的前述收獲的細胞器的噬菌體；i)選擇具有最高滴度的噬菌體，并從噬菌體獲得突變的多核苷酸的序列；以及j)產生由前述序列編碼的多肽，其中該多肽是靶向至細胞器的藥物遞送分子。在另一實施方式中，細胞器選自由線粒體、高爾基體、內質網、細胞核、核糖體、質膜和胞質溶膠所組合的組。在另一實施方式中，細胞是哺乳動物細胞或非哺乳動物細胞。在另一實施方式中，使用下述的任何一種或多種產生突變體:基于PCR的方法、化學誘變、紫外線誘導的誘變或其組合。在另一實施方式中，藥物遞送分子包括靶向結構域、核內體裂解配體結構域和帶正電荷的結構域。
[0007]其他實施方式包括一種用于將治療劑遞送至細胞器的載體，所述載體包括由增強進入至細胞的一個或多個五鄰體基質(PB)突變編碼的多肽。在另一實施方式中，一個或多個五鄰體基質(PB)突變包括IllC和/或333F。在另一實施方式中，載體進一步包括聚賴氨酸模體。在另一實施方式中，載體進一步包括調蛋白的靶向結構域。在另一實施方式中，一個或多個PB突變包括C-末端缺失。
[0008]其他實施方式包括一種治療劑，該治療劑包括載體和治療性藥物，所述載體用于將治療劑遞送至細胞器，所述載體包括由增強進入至細胞的一個或多個五鄰體基質(PB)突變編碼的多肽。在另一實施方式中，治療性藥物是化學治療劑。
[0009]各種其他實施方式包括生產不具有增殖活性的載體的方法，包括:a)獲得編碼調蛋白(Her)受體結合結構域的多核苷酸，并在該多核苷酸中產生突變體；b)將突變的Her多核苷酸克隆至噬菌體載體，并產生包括噬菌體載體的噬菌體文庫；c)在存在有絲分裂抑制劑的情況下，用噬菌體文庫轉化MDA-MB-435細胞；d)分級分離前述轉化的細胞，并提取MDA-MB-435細胞的膜級分；e)從膜級分收獲膜噬菌體；f)在存在有絲分裂抑制劑的情況下，將膜噬菌體轉化為MDA-MB-435細胞；g)重復步驟(d)、(e)和(f) ；h)監測每輪的MDA-MB-435細胞增殖，并選擇具有最低MDA-MB-435細胞增殖的膜噬菌體；i)在所選擇的膜噬菌體中獲得Her多核苷酸的突變體的序列；以及j)產生由Her序列和五鄰體基質基因編碼的多肽，其中該多肽是不具有增殖活性的載體。
[0010]其他實施方式包括用于將治療劑遞送至細胞核的載體，其包括由突變的Her序列編碼的多肽。在另一實施方式中，該載體進一步包括編碼五鄰體基質(PB)蛋白的多肽，以及聚賴氨酸模體。在另一實施方式中，PB蛋白是突變體五鄰體基質蛋白。
[0011]其他實施方式包括一種治療劑，其包括載體和治療性藥物。
【附圖說明】
[0012]圖1表示根據本文的實施方式的生物淘選策略；
[0013]圖2表示根據本文的實施方式的五鄰體基質基因基于PCR的隨機誘變。基于密度測定法分析，PCR產物(剛好在1600bp條帶之上)包含10ng DNA，得到約4800ng的總產量。因為初始革G DNA是97ng，因此產量/初始量之比是約50并且復制數(duplicat1nnumber)是約 5.6，用制造商的規程(Genemorph II，Strategene, La Jolla, CA，USA)中提供的標準曲線外推時，對應的突變率為?8/kb ；
[0014]圖3表示根據本文的實施方式的表達五鄰體基質變體的噬菌體的分離，所述五鄰體基質變體向細胞核區室的劃分被增強。按照細胞結合和攝入部分描述的條件，以lxl0~8pfu將表達隨機誘變的PB的T7噬菌體文庫添加至1χ10~6的HeLa細胞。通過胰酶消化去除任何表面結合的噬菌體來收獲細胞，然后使用市售分級分離試劑盒(QproteomeCell Compartment Kit (細胞區室試劑盒)；Qiagen Inc.，Valencia, CA, USA)進行分級分離。按照標準程序進行PEG-沉淀過夜從而從每個級分使噬菌體沉淀，然后再懸浮于TB細菌培養基中，并且添加至BLT5403細菌中以擴增分離的噬菌體。通過噬菌斑測定法來滴定擴增的噬菌體，然后在HeLa上使用如之前描述的相同滴定和條件進行再淘選。對于從細胞溶質級分獲得的噬菌體，進行3輪的細胞溶質生物淘選，而對于從細胞核級分獲得的進行2輪；
[0015]圖4表示根據本文的實施方式的由生物淘選分離的運輸變體的比對；
[0016]圖5表示根據本文的實施方式的全長突變體IllC展示出增強的向細胞質和細胞核的運輸。圖5(A)通過丙酮沉淀法從每個級分使蛋白質沉淀，并且將小球再懸浮在40uL脫鹽緩沖液中，隨后通過SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)和蛋白質印記法分析。圖5(B)表示使用Image J進行的條帶密度分析，顯示出與野生型蛋白質相比，IllC在細胞溶質和細胞核級分中都增加。運輸和細胞分級分離試驗:將在燒瓶中生長的粘附HeLa細胞通過用5mLlXPBS+2mM EDTA在37°C攪拌孵育50min解粘附，并且轉移至15mL圓錐形管。測量細胞的密度，并且將細胞以每管5xl06個細胞分散至分開的管。用IX PBS+Ca2++Mg2+洗滌細胞三次以去除EDTA，并且將細胞小球再懸浮于0.7ml緩沖液A(20mM HEPES，pH 7.4 ；2mM MgCl2;DMEM中的3%BSA)中。將野生型(WT)或突變體(111C，333F)五鄰體基質蛋白(450ug)添加至分開的細胞等份中，并且將混合物在4°C攪拌孵育2hrs，以促進受體結合，隨后在37攝氏度攪拌孵育2h，以促進結合受體的蛋白質的內化。對照處理沒有接收蛋白質(NP)。然后收集并且處理細胞，以用于使用Qproteome Cel