山稻百靈谷7號的分子特異性標記引物及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及山稻百靈谷7號的分子特異性標記引物及其鑒定方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 山稻在我國具有悠久的栽培歷史，分布廣泛，尤以云南、貴州等少數民族聚居地為 多，主要采用游耕性質的刀耕火種生產方式。長期的自然選擇和人工培育，形成了我國豐富 的山稻種質資源。近年來，隨著林下經濟的發展，建設各種規模大、效益好、帶動力強的林下 經濟發展模式，已成為國家對發展林下經濟所要實現的主要目標。然而長期以來，中國山稻 主產地的山稻生產、銷售一直較為混亂，"異種同名、同種異名"現象普遍存在，特別是一些 優良品種頻繁被假冒而出現在山稻種質資源市場上，極大地損害了山稻育種者和生產者的 利益。因而對于山稻品種，建立一種簡便、快速、可靠的優良品種鑒定技術尤為迫切。
[0003] 分子生物學技術的快速發展，特別是分子標記技術的建立與成熟，為發展簡便、快 速、準確的菌種鑒定技術提供了有效手段。一些基于PCR的分子標記技術如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性 DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態性）在上個世紀90年代已用于各類物種的分類鑒定上， 但這些標記用于山稻品種的鑒定均不夠理想。SCAR (Sequence CharacterizedAmplified Region，特征性片段擴增區域）標記是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基礎上提出 的，它基于對特異RAro片段的測序，根據兩端序列設計一對18?24堿基的引物，在較高的 退火溫度下進行特異擴增實現的，其專一性引物的采用排除了隨機引物結合位點之間的競 爭，因而它是一種十分穩定的分子標記，在應用上具有迅速、簡便、低成本的特點。 (三）
【發明內容】
[0004] 本發明目的是提供山稻百靈谷7號的分子特異性標記引物，以及一種能對山稻百 靈谷7號進行快速鑒定的方法。
[0005] 本發明采用的技術方案是：
[0006] 山稻山稻百靈谷7號的分子特異性標記引物，所述引物序列如下：
[0007] 上游引物：5，-AGCGGCCGCTGGCATGG-3，，
[0008] 下游引物：5' -CCATGCCAGCGGCCGCT-3'。
[0009] 該引物對是采用PCR技術，經過大量篩選試驗獲得山稻百靈谷7號的特異性DNA 片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎設計特異性引物，以該特異性引物 對山稻品種進行PCR擴增，僅山稻百靈谷7號可獲得742bp的特異性片段，其他山稻品種均 不能獲得特異性片段。需要說明的是，本發明分子特異性標記引物僅限于山稻品種的鑒定 (鑒定其是否為山稻百靈谷7號），即待測樣品僅限于山稻。
[0010] 本發明還涉及一種利用所述的分子特異性標記引物對山稻百靈谷7號進行快速 鑒定的方法，所述方法為：提取待測山稻品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特 異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現 742bp左右大小的特異DNA條帶，則待測山稻品種為山稻百靈谷7號，反之則否；所述分子 特異性標記引物序列為：
[0011] 上游引物：5' -AGCGGCCGCTGGCATGG-3'，
[0012] 下游引物：5' -CCATGCCAGCGGCCGCT-3'。
[0013] 本發明方法關鍵在于擴增引物的選擇、DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領域常規方法進行。
[0014] 優選的，本發明所述PCR擴增體系組成如下：
[0015] PCR Buffer 終濃度為I x dNTPs I mmol/L MgCl2 2.5mmol/L Taq DNA 酶 2.5U 上、下游引物 各1.25μΜ 模板 DNA 60ng
[0016] 余量為 ddH2〇;
[0017] PCR擴增條件如下：
[0018] 先 94°C 預變性 6min ;
[0019] 92°C變性 40s、68°C退火 40s、72°C延伸 2min，共 30 個循環；
[0020] 最后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0021] PCR Buffer終濃度為IX，是指PCR Buffer中各組分在反應體系中的濃度與 IXPCR Buffer相同，通常選用體積為反應體系體積1/10的IOXPCR Buffer。IOXPCR Buffer 成分為：100mM Tris-HCl (pH 8. 5)、500mM KCl、25mM MgCljP 1.0% Triton-X-100， 溶劑為ddH20。
[0022] 具體的，所述方法如下：
[0023] (1)取待測山稻葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測山稻葉片的基因組 DNA ；
[0024] (2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引 物，進行PCR擴增：
[0025] PCR擴增體系每20 μ L組成如下：
[0026] lOxPCR Buffer 2μ? I Ommo I/L dNTPs 2μ? 25mmol/L MgC^ 2μ? 5U4iLTaq DNA 酶 0.5μΙ_, 25μΜ上、下游引物 各IpL 20ng/pL 模板 DNA 3pL
[0027] ddH20 補足至 20 μ L ;
[0028] PCR擴增條件如下：
[0029] 94°C預變性6min ;92°C變性40s，68°C退火40s，72°C延伸2min，共30個循環；最后 于72°C補平7min，終止溫度為4°C ;
[0030] (3)取步驟⑵擴增產物5 μ L，與1 μ L 0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勾，點樣于1. 5% 的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后EB染色，于自動凝膠 圖像分析儀上照相，若電泳結果出現742bp的DNA條帶，則待測山稻品種為山稻百靈谷7 號，反之則否。
[0031] 本發明有益效果主要體現在：本發明分子特異性標記引物可對山稻百靈谷7號進 行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別山稻品種所不能替代的分子手 段。 (四）
【附圖說明】
[0032] 圖1為對山稻品種進行PCR擴增的結果；M為DNA分子量標準；箭頭所指為從編號 為17的山稻百靈谷17號品種擴增出的分子量為750bp左右大小的特殊DNA條帶；其余編 號為其它常用的山稻生產品種，未見有750bp左右大小的特異DNA條帶產生。 (五）
【具體實施方式】
[0033] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0034] 實施例1 :
[0035] (1)基因組DNA的提取：基因組DNA的提取采用以SDS-CTAB法進行提取。純化的 基因組DNA先用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳定性檢測，再用DNA/RNA紫外分光光度計定量檢 測。DNA提取物于-20 °C冰箱貯藏備用。
[0036] (2)設計特異PCR擴增引物，引物對的序列為上游引物 5' -AGCGGCCGCTGGCATGG-3 '和下游引物 5' -CCATGCCAGCGGCCGCT-3 '，由上海生工生物 工程技術有限公司合成。
[0037] (3) SCAR分子標記的PCR擴增：
[0038] PCR擴增體系每20 μ L組成如下：
[0039] IOxPCR Buffer 2pL 10mmol/L dNTPs 2pL 25mmol/L MgCb 2μ? 5U，VLTaqDNA 酶 0.5μ? 25μΜ上、下游引物 各IpL 20_L 模板 DNA 3pL
[0040] CldH2O 補足至 20 μ L ;
[0041] 擴增反應在TC-XP型擴增儀上進行。
[0042] PCR擴增條件如下：
[0043] 94°C預變性6min ;92°C變性40s，68°C退火40s，72°C延伸2min，共30個循環；最后 于72°C補平7min，終止溫度為4°C ;
[0044] (4)電泳檢測：取步驟（3)PCR擴增產物5ul，與Iul 0· 25%溴酚蘭緩沖液混勻， 點樣于1. 5%的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結束后，在含 0. 5 μ g/mlEB的水溶液中染色30分鐘，然后在培清JS-380A自動凝膠圖像分析儀上照相。
[0045] 按照上述方法，分別對多種水稻和山稻（編號1?24代表山稻及水稻品種依次 為:甬優538 ;2 :百靈谷12號；3 :中旱221 ;4 :百靈谷15號；5 :春江119 ;6 :百靈谷10號； 7 :雜交岳伏9113 ;8 :百靈谷16號；9 :百靈谷4號；10 :百靈谷18號；11 :百靈谷2號；12 : 百靈谷5號；13 :百靈谷19號；14 :百靈谷1號；15 :百靈谷3號；16 :百靈谷9號；17 :百靈 谷7號；18 :百靈谷6號；19 :百靈谷13號；20 :百靈谷17號；21 :百靈谷20號；22 :百靈谷 11號；23 :百靈谷14號；24 :百靈谷8號）進行檢測，電泳結果見圖1。
[0046] 其中編號17為山稻百靈谷7號品種，擴增出一條清晰明亮、穩定的分子量為750bp 左右的特殊DNA條帶，其余編號為其他常用的山稻生產品種，未見有750bp左右的特殊DNA 條帶產生，也未有其它非目的條帶產生，可見本發明開發出的分子特異性標記用于山稻百 靈谷7號的鑒定，其穩定性好、特異性高。
【主權項】
1. 山稻百靈谷7號的分子特異性標記引物，所述引物序列如下： 上游引物：5' -AGCGGCCGCTGGCATGG-3'， 下游引物：5' -CCATGCCAGCGGCCGCT-3'。
2. -種利用權利要求1所述的分子特異性標記引物對山稻百靈谷7號進行快速鑒定的 方法，所述方法為：提取待測山稻品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標記 引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現742bp的特 異DNA條帶，則待測山稻品種為百靈谷7號，反之則否；所述分子特異性標記引物序列為： 上游引物：5' -AGCGGCCGCTGGCATGG-3'， 下游引物：5' -CCATGCCAGCGGCCGCT-3'。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下：94°C預變性6min; 92°C變性40s，68°C退火40s，72°C延伸2min，共30個循環；最后于72°C補平7min，終止溫 度為4°C。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1) 取待測山稻葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測山稻葉片的基因組DNA; (2) 以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物， 進行PCR擴增： PCR擴增體系每20yL組成如下： l〇xPCRBuffer 2jiL 10mmol/LdNTPs 2jiL 25mmol/LMgC.h 2jiL 5U/|iLTaqDNA酶 0.5gL 25(iM上、下游引物 各IjiL 20ng/jaL模板DNA 3jiL ddH20 補足至 20(_lL: PCR擴增條件如下： 94°〇預變性6!^11;921：變性4〇8,681：退火4〇8,721：延伸2111111，共30個循環 ；最后于 72°C補平7min，終止溫度為4°C; (3) 取步驟（2)擴增產物5yL，與1yL0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5%的瓊 脂糖凝膠上，于1XTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后EB染色，于自動凝膠圖像 分析儀上照相，若電泳結果出現742bp的DNA條帶，則待測山稻品種為百靈谷7號，反之則 否。
【專利摘要】本發明涉及一對特異性高的山稻百靈谷7號的分子特異性標記引物，以及一種能對山稻百靈谷7號進行快速鑒定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCTGGCATGG-3′，下游引物：5′-CCATGCCAGCGGCCGCT-3′。本發明分子特異性標記引物可對山稻百靈谷7號進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別山稻品種所不能替代的分子手段。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104611437
【申請號】CN201510049982
【發明人】王麗玲, 劉本同, 秦玉川, 錢華, 王衍彬
【申請人】浙江省林業科學研究院
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月30日