一種變溫轉染技術的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物基因工程領域，更加具體地，涉及一種變溫轉染技術。
【背景技術】
[0002]轉染(Transfect1n)，指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程，亦即將DNA結構物從細胞外帶入細胞內并得到轉錄和表達的過程。
[0003]常規轉染技術可分為兩大類，一類是瞬時轉染，一類是穩定轉染(永久轉染)，其中，瞬時轉染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達，但通常只持續幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析，一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后24?72小時內(依賴于各種不同的構建)分析結果，常常用到一些報告系統如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測；穩定轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體Gpisome)存在。
[0004]線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。
[0005]由于外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉移酶(ΑΡΗ;新霉素抗性基因)，潮霉素B磷酸轉移酶(HPH)，胸苷激酶(TK)等反復篩選，得到穩定轉染的同源細胞系。
[0006]轉染技術又可分為化學轉染法和物理轉染法，其中，化學轉染法包括:(I)DEAE-葡聚糖法，DEAE-葡聚糖是最早應用于哺乳動物細胞轉染的試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負電的核酸結合后接近細胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉染能成功地應用于瞬時表達的研宄，但用于穩定轉染卻不是十分可靠；(2)磷酸鈣法，是磷酸鈣共沉淀轉染法，因為試劑易取得，價格便宜而被廣泛用于瞬時轉染和穩定轉染的研宄，先將DNA和氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的混懸液加到培養的細胞上，通過細胞胞膜的內吞作用攝入DNA，磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細胞內的核酸酶活性而保護外源DNA免受降解；(3)人工脂質體法，采用陽離子脂質體，具有較高的轉染效率，不但可以轉染其他化學方法不易轉染的細胞系，而且還能轉染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA，和蛋白質，此外，脂質體體外轉染同時適用于瞬時表達和穩定表達，與以往不同的是脂質體還可以介導DNA和RNA轉入動物和人的體內用于基因治療。LipoFiterTM 脂質體轉染試劑(LipoFiterLiposomalTransfect1nReagent)是一種適合于把質粒或其它形式的核酸，以及核酸蛋白復合物轉染到培養的真核細胞中的高效陽離子脂質體轉染試劑，它可以和帶負電荷的核酸結合后形成復合物，當復合物接近細胞膜時被內吞成為內體進入細胞質，隨后DNA復合物被釋放進入細胞核內，至于DNA是如何穿過核膜的，其機理目前還不十分清楚。
[0007]物理法包括:(I)顯微注射法，顯微注射雖然費力，但是非常有效的將核酸導入細胞或細胞核的方法，這種方法常用來制備轉基因動物，但卻不適用于需要大量轉染細胞的研宄；(2)電穿孔法，電穿孔法常用來轉染如植物原生質體這樣的常規方法不容易轉染的細胞，電穿孔靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞內，導入的效率與脈沖的強度和持續時間有關系；(3)基因槍法，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導入細胞內，這種方法適用于培養的細胞核在體的細胞。
[0008]現有的磷酸鈣轉染、脂質體轉染、電穿孔等多種技術存在各種不足，其中磷酸鈣轉染配液要求高，轉染效率較低，且不穩定；脂質體轉染效果好，脂質體價格貴，一些脂質體材料會對細胞造成影響；而顯微注射、電穿孔和電子槍等方法轉染成功效率高而穩定，但由于設備昂貴，普及并不廣，多用于特殊要求難度高的情況。
【發明內容】
[0009]為了解決上述現有轉染技術中尚存在的問題，本發明提出了一種變溫轉染技術。
[0010]一種變溫轉染技術，包括如下步驟:
1)利用培養液培養細胞；
2)收集目的細胞:
2.1)吸掉所述步驟I)中培養液的上清；
2.2)用3ml PBS清洗兩次；
2.3)加入0.25%胰酶，使大部分細胞脫落懸浮起來；
2.4)加入含血清的培養液，中和胰酶，終止消化，得到細胞懸液；
2.5)對步驟2.4)中所述細胞懸液在常溫下，以100rpm速度離心處理；
2.6)去除離心后得到的細胞懸液上清，得到目的細胞；
3)細胞與DNA物質混勻后進行變溫:
3.1)利用20 μ I DMS0、180ul新鮮培養液配制得到凍存液；
3.2)在所述目的細胞中加入500 μ I新鮮培養液，再加入所述凍存液，混勻；
3.3)在_80°C條件下，凍存一夜；
3.4)在37°C條件下，解凍；
3.5)無菌條件下，在解凍后得到的液體中，加入新鮮培養液；
3.6)對將步驟3.5)中得到的液體在常溫下，以100rpm速度離心處理；
3.7)利用20ng質粒和Iml培養液配制轉染液；
3.8)去掉步驟3.6)中上清，并加入步驟3.7)中所述轉染液，混勻；
4)培養??每3天進行一次傳代培養。
[0011]較佳地，所述培養液使用包括但不限于DMEM/F12、FBS、Penicillin_Streptomycin等原料配制，其中Penicillin-Streptomycin，每毫升包含10000單位青霉素(堿)和1000yg鏈霉素(堿)，利用0.85%鹽液形式的青霉素G(鈉鹽)和硫酸鏈霉素。
[0012]較佳地，所述血清包括但不限于優質胎牛血清。
[0013]本發明的基本原理和有益效果是，利用細胞在凍存和復蘇過程中細胞膜松散，容易吸收外源物質的原理，通過將細胞進行物理變溫，在變溫過程中產生細胞膜的間隙，使外源物質進入細胞，從而達到轉染的目的，所述技術用料簡單，操作簡單，成本低廉，無需專業設備即能做到DNA物質的轉移，轉染效果好，無需轉染后換液且無大量特殊外源化合物對細胞的影響。
【具體實施方式】
[0014]具體實施例1
[0015]一種變溫轉染技術，包括如下步驟:
1)利用培養液培養細胞；
2)收集目的細胞:
2.1)吸掉所述步驟I)中培養液的上清；
2.2)用3ml PBS清洗兩次；
2.3)加入2ml 0.25%胰酶，使大部分細胞脫落懸浮起來；
2.4)加入含胎牛血清的培養液，中和胰酶，終止消化，得到細胞懸液；
2.5)對步驟2.4)中所述細胞懸液在常溫下，以100rpm速度離心5min ；
2.6)去除離心后得到的細胞懸液上清，得到目的細胞；
3)細胞與DNA物質混勻后進行變溫:
3.1)利用20 μ I DMS0、180ul新鮮培養液配制得到凍存液；
3.2)在所述目的細胞中加入500 μ I新鮮培養液，再加入所述凍存液，混勻；
3.3)在_80°C條件下，凍存一夜；
3.4)在37°C條件下，解凍；
3.5)無菌條件下，在解凍后得到的液體中，加入新鮮培養液；
3.6)對將步驟3.5)中得到的液體在常溫下，以100rpm速度離心處理；
3.7)利用20ng質粒和Iml培養液配制轉染液；
3.8)去掉步驟3.6)中上清，并加入步驟3.7)中所述轉染液，混勻；
4)培養??每3天進行一次傳代培養。
[0016]其中，所述培養液使用包括但不限于DMEM/F12、FBS、Penicillin-Streptomycin等原料配制，其中Penicillin-Streptomycin，每毫升包含10000單位青霉素(堿)和1000yg鏈霉素(堿)，利用0.85%鹽液形式的青霉素G(鈉鹽)和硫酸鏈霉素。
[0017]具體實施例2
[0018]使用6孔培養板培養一個孔的CHO細胞，當細胞達到80%時，進行目的細胞收集處理；吸掉上清；加入注射用生理鹽水，輕輕平遙培養板，再洗掉生理鹽水，重復一次；加入2ml 0.25%的胰酶，消化脫落CHO細胞；加入含胎牛血清的培養液終止消化；吹打均勻細胞，將細胞懸液加入到15ml離心管中，在室溫下，以100rpm速度，離心時間5min ;離心完后倒掉上清；配制200 μ I由包括但不限于20 μ I DMS0、180ul新鮮培養液和1ng質粒組成的凍存液；將凍存液加入到所述目的細胞中，混勻后加入所述凍存液中，放入凍存盒中；將凍存盒放入_80°C過夜；第二天，取出凍存管，放入37°C水中，急速解凍；解凍完畢立即在超凈工作臺中向凍存管中加入新鮮培養液；并轉移到15ml離心管中，以100rpm速度在室溫下離心5min，離心完成后去上清，再加入由包括但不限于20ng轉染質粒和Iml培養液組成的所述轉染液，混勻后，將其轉移到6孔板中培養。
【主權項】
1.一種變溫轉染技術，其特征在于所述技術包括如下步驟: 1)利用培養液培養細胞； 2)收集目的細胞: 2.1)吸掉所述步驟I)中培養液的上清； 2.2)用3ml PBS清洗兩次； 2.3)加入0.25%胰酶，使大部分細胞脫落懸浮起來； 2.4)加入含血清的培養液，中和胰酶，終止消化，得到細胞懸液； 2.5)對步驟2.4)中所述細胞懸液在常溫下，以100rpm速度離心處理； 2.6)去除離心后得到的細胞懸液上清，得到目的細胞； 3)細胞與DNA物質混勻后進行變溫: 3.1)利用20 μ I DMS0、180ul新鮮培養液配制得到凍存液； 3.2)在所述目的細胞中加入500 μ I新鮮培養液，再加入所述凍存液，混勻； 3.3)在_80°C條件下，凍存一夜； 3.4)在37°C條件下，解凍； 3.5)無菌條件下，在解凍后得到的液體中，加入新鮮培養液； 3.6)對將步驟3.5)中得到的液體在常溫下，以100rpm速度離心處理； 3.7)利用20ng質粒和Iml培養液配制轉染液； 3.8)去掉步驟3.6)中上清，并加入步驟3.7)中所述轉染液，混勻； 4)培養:每3天進行一次傳代培養。
2.根據權利要求1所述技術，其特征在于所述培養液使用包括但不限于DMEM/F12、FBS、Penicillin-Streptomycin 等原料配制，其中 Penicillin-Streptomycin，每毫升包含10000單位青霉素(堿)和1000yg鏈霉素(堿)，利用0.85%鹽液形式的青霉素G(鈉鹽)和硫酸鏈霉素。
3.根據權利要求1所述技術，其特征在于所述血清包括但不限于優質胎牛血清。
【專利摘要】一種變溫轉染技術，包括如下步驟：利用培養液培養細胞；收集目的細胞；細胞與DNA物質混勻后進行變溫；傳代培養。本發明的基本原理和有益效果是，利用細胞在凍存和復蘇過程中細胞膜松散，容易吸收外源物質的原理，通過將細胞進行物理變溫，在變溫過程中產生細胞膜的間隙，使外源物質進入細胞，從而達到轉染的目的，所述技術用料簡單，操作簡單，成本低廉，無需專業設備即能做到DNA物質的轉移，轉染效果好，無需轉染后換液且無大量特殊外源化合物對細胞的影響。
【IPC分類】C12N15-85
【公開號】CN104611367
【申請號】CN201510017122
【發明人】易銀沙, 成光杰, 戴燕山, 朱海強, 許澎, 劉彩云, 袁炳秋, 吳小寧
【申請人】長沙贏潤生物技術有限公司
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月6日