一種鏈霉菌菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業微生物領域，涉及一種具有纖維素降解能力的鏈霉菌菌株及其在 秸桿腐熟方面的應用。
[0002]
【背景技術】
[0003] 秸桿具有資源豐富，來源廣泛，資源化利用率低，研究開發潛力大等特點，因而其 資源化問題成為科研熱點之一。我國是農業大國，秸桿資源豐富，年產秸桿量在8億噸以 上，雖然數量巨大，但是利用率低，全國每年約有60%以上的秸桿被焚燒或是廢棄，這樣不 僅影響交通、誘發火災、嚴重污染環境、破壞生態平衡，而且又浪費了寶貴的生物資源。微 生物是自然界物質分解者，在維持生態平衡和物質轉化方面發揮著其他生物無法取代的作 用。環境中的微生物具有分布廣泛、種類繁多、數量巨大、功能多樣等特點，應用微生物發酵 的方法對秸桿進行腐解處理是其他理化方法所不能替代的，前景非常廣闊。由于秸桿主要 是由纖維素、半纖維素和木質素組成，易被利用的水溶性碳水化合物含量較低，化學結構復 雜，具有很強的抗分解能力。又因為多數作物秸桿的表面有一層蠟質層，使微生物對其降解 的難度增大。
[0004] 降解纖維素的微生物有：①細菌。雖然種類遠不如真菌多，但在土壤等環境中分 布的數量卻很多，如：芽孢桿菌屬（你生孢食纖維菌屬A§a)、假單 胞菌屬纖維單胞菌屬（CfeBy/offlmas)等，最適生長溫度大都在30~40°C 之間。同時細菌降解木質素的能力比真菌低得多。②真菌。真菌對木質纖維素的分解起 著重要作用。在中溫條件下，主要有木霉屬O-ricAoofe r?a)、曲霉屬（J1SpergiBw1S)和青 霉屬其中木霉屬真菌的纖維素酶應用最多，能加速秸桿分解進程，縮短堆 肥時間。③放線菌。目前秸桿分解微生物的大部分研究集中在真菌和細菌，關于放線菌 的研究較少。主要有：諾卡氏菌屬（Abcart/ia)、鏈霉菌屬高溫放線菌屬 等。由于細菌產纖維素酶量低且多為胞內酶，因此很少用來生產纖 維素酶，而且，細菌中除芽孢桿菌外其它的種類由于保存期限的問題以及相關胞外酶的誘 導表達量比較低，在實際應用中受到限制。涉及纖維素降解的真菌很多，在環境中的中溫型 纖維素降解菌中大多數是真菌，但是很多都是植物病原菌且傳染性強，很難將其開發為秸 桿降解劑，這就導致細菌和真菌在纖維素降解的進一步應用研究中比較困難。
[0005] 原核生物放線菌比真菌更具有抗逆性，在高溫階段木質素和纖維素的分解過程 中，放線菌起著重要的作用，并且放線菌產纖維素酶活性較高，結構簡單，便于基因改造和 遺傳分析，但是，放線菌繁殖慢且產酶能力沒有真菌強。因此，將放射菌應用于秸桿腐熟技 術上，最關鍵的問題是高效接種菌劑的篩選，從而促進秸桿腐熟的過程，提高秸桿腐熟的效 率。
【發明內容】
[0006] 本發明提供一種新型鏈霉菌，屬放射菌目一科，以解決現有技術中秸桿腐熟過程 緩慢、效率不高，而現有秸桿腐熟劑應用受限等問題。
[0007] 本發明提供一種鏈霉菌菌株，所述鏈霉菌菌株（5/7.)的名稱為纖維 素分解菌F1，于2015年1月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 菌種保藏號為CGMCC NO. 10359。地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院 微生物研究所，郵編：1〇〇1〇1。
[0008] 該菌株呈現典型的放線菌菌落形態，菌落為密氈狀，產生灰色的孢子，基內菌絲為 白色。
[0009] 2.上述1提供的鏈霉囷囷株在結桿腐熟中的應用。
[0010] 3.本發明還提供一種秸桿腐熟劑，該秸桿腐熟劑包括上述1提供的鏈霉菌孢子。
[0011] 4.上述3提供的結桿腐熟劑，其中，腐熟劑成品中鏈霉囷抱子總濃度為 2 X 109CFU/mL。
[0012] 5.本發明還提供一種秸桿腐熟效果測試方法，該方法將秸桿的一端固定，另一端 連接彈簧秤，用力拉彈簧秤并記錄秸桿斷裂時的重量即拉力；同一時期秸桿的拉力越小，即 越易被拉斷，說明秸桿腐熟程度越高。
[0013] 有益效果： 1.本研究從不同樣本中分離、篩選到高效降解秸桿纖維素的優勢鏈霉菌菌種，經過 48h后就能在秸桿上生長，72h長出大量菌絲，并產生大量孢子。說明本發明提供的鏈霉菌 活力高，適應性強，可廣泛用于秸桿的腐化處理過程中。再通過水稻秸桿的好氧堆肥中試研 究，為秸桿的綜合利用提供理論參考，開發出能夠應用于農業生產的微生物秸桿腐熟菌劑。
[0014] 2.通過篩選獲得的纖維素分解菌F1，經過馴化成高效穩定的菌株并制成秸桿腐 熟劑，經過試驗，接種分解菌Fl的秸桿10天便開始變軟、腐爛，此時分解率便已經超過20%， 經過25天，秸桿已經完全降解，說明制成的秸桿腐熟劑縮短了堆肥發酵周期，提高腐解速 率。應用于秸桿腐解、還田過程，既可以增加土壤中的有機質含量，培肥地力，改善土壤結 構，有利于實現農業的可持續發展，同時減少了化肥和農藥的使用量，降低了農業面源污 染，提高作物產量及品質，又減少了因秸桿焚燒引起的空氣污染等環境問題。
[0015] 3.本發明創造性地提出以秸桿剪切拉力作為秸桿腐熟效果測定的一個指標，方法 簡單易測，適合于農業生產應用，值得推廣。
[0016]
【附圖說明】
[0017]圖1本發明提供的纖維素分解菌Fl的菌落形態 圖2菌株Fl在CMC-Na剛果紅平板上的透明圈 圖3菌株對濾紙的崩解情況 圖4培養時間對Fl的酶活性影響 圖5 IOd后不同菌株對水稻結桿的降解率 圖6纖維素降解菌對水稻秸桿堆肥效果的研究
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例對本發明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照本領域的公知手段，或按照制造廠商的建議條件。
[0019] 本研究采用以下4種指標作為堆肥的評價標準，即秸桿顏色、秸桿剪切拉力。
[0020] ①顏色：顏色可以用來判斷堆肥腐熟的指標。一般認為秸桿顏色達到深褐色或灰 黑色為宜，并有光澤。
[0021] ②秸桿剪切拉力：是最近新提出的測定秸桿腐熟的方法，以前很少有學者用這個 指標作為評價標準，所以該方法的使用增加了本文的創新性。秸桿剪切拉力即秸桿拉力，為 秸桿最大承受力，測定方法是將秸桿的一端固定，另一端連接彈簧秤，用力拉彈簧秤并記錄 秸桿斷裂時的重量。同一時期秸桿的拉力越小，即越易被拉斷，說明秸桿腐熟程度越高。
[0022] 實施例1 纖維素分解菌Fl的篩選與鑒定 以下試驗用培養基在制備過程中均在121°C滅菌20 min。
[0023] 1)從不同地域收集的腐敗樹枝和秸桿樣品，以蒸餾水浸泡水稻秸桿、枯枝敗葉，過 夜，去除可溶性有機物，沖洗數次，烘干待用。將水稻秸桿、枯枝敗葉剪成2cm左右樣品，作 為接下來富集培養基的唯一碳源。
[0024] 配制富集培養基【赫奇遜（Hutchinson)秸桿培養基】:磷酸二氫鉀（KH 2PO4) I. 0 g， 氯化鈉（NaCl )0.1 g，氯化鐵（FeCl3.640)0. 01 g，硫酸鎂（MgSO4.740)0. 3 g，硝酸鈉 (NaNO3) 2. 5 g，氯化鈣（CaCl2 ? 6H20) 0? I g，蒸餾水 1000 mL。
[0025] 稱取2cm左右樣品10 g，轉移至裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，180 rpm 搖床振蕩20 min,靜置，用移液器吸取I mL懸液轉移至裝有富集培養基的三角瓶中，放于 55°C水浴鍋中振蕩培養，待秸桿松散變軟后，轉接到新鮮的上述培養基中，接種量為質量分 數5%，如此轉接數代，淘汰不能在培養基中生長的菌群，即沒有分解纖維素能力的菌群。
[0026] 2)配制分離培養基（CMC-Na剛果固體紅培養基）：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na) 10. 0 g，硝酸鉀（KNO3) 1.0 g，磷酸氫二鉀（K2HPO4) 0.5 g，硫酸鎂(MgSO4 *740)0. 5 g，氯化鈉 (NaCl)L 5 g，剛果紅 0.2 g，瓊脂 13 g，蒸饋水 1000 mL。
[0027] 將上述轉接數代后的培養基采用稀釋涂布平板法在CMC-Na剛果紅固體培養基上 分離，置于55°C恒溫培養箱中培養獲得單菌落，通過目測，選擇菌落較大(較大是一個相對 概念，比較范圍是整個培養基中生長的菌落)、透明圈較大的菌落(如圖2所示)，以此為標準 選擇在以纖維素為唯一碳源的條件下生長較好的菌株，從而得到分解纖維素能力較強的菌 株。在CMC-Na剛果紅固體培養基上反復劃線純化。在CMC-Na平板用0. 02%的剛果紅溶液 染色20 min，然后用I mol/L的NaCl脫色20 min，觀察并記錄透明圈的直徑（D，cm)和菌落 直徑（d，cm)，計算其比值H，即H=D/d。由于H值越大，表示該菌株分解纖維素的能力越強， 因此，選擇H值大的透明圈所對應的菌株F1。按照剛果紅鑒定培養基上形成透明圈的大小 即通過纖維素酶定性實驗初步確定其產纖維素酶活性。
[0028] 采用伯杰氏細菌手冊上的方法，測定分離菌株的生化特性，結果如表1 表1菌株Fl的生理生化特性
【主權項】
1. 一種鏈霉菌菌株，其特征在于：所述鏈霉菌菌株（5/7.)的名稱為纖維 素分解菌F1，于2015年1月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 菌種保藏號為CGMCC NO. 10359。
2. 權利要求1所述的鏈霉菌菌株在秸桿腐熟中的應用。
3. -種秸桿腐熟劑，其特征在于：該秸桿腐熟劑包括權利要求1所述的鏈霉菌孢子。
4. 權利要求3所述的秸桿腐熟劑，其特征在于：腐熟劑成品中鏈霉菌孢子總濃度為 2X109CFU/mL。
5. -種秸桿腐熟效果測試方法，其特征在于：將秸桿的一端固定，另一端連接彈簧秤， 用力拉彈簧秤并記錄秸桿斷裂時的重量即拉力；同一時期秸桿的拉力越小，即越易被拉斷， 說明秸桿腐熟程度越高。
【專利摘要】本發明屬于農業微生物領域，涉及一種具有纖維素降解能力的鏈霉菌菌株及其在秸稈腐熟方面的應用。該鏈霉菌菌株（Streptomyces sp.）名稱為纖維素分解菌F1，于2015年1月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.10359。本發明提供的鏈霉菌菌種，經過48h后就能在秸稈上生長，72h長出大量菌絲，并產生大量孢子，說明該菌種活力高，適應性強，可廣泛用于秸稈的腐化處理過程中。以該菌株孢子制成的秸稈腐熟劑，經過試驗，秸稈10天便開始變軟、腐爛，此時分解率已超過20%，經過25天，秸稈已經完全降解，說明制成的秸稈腐熟劑縮短了堆肥發酵周期，提高腐解速率。CGMCC No.1035920150114
【IPC分類】C12N1-20, C05F17-00, C12R1-465, G01N3-08
【公開號】CN104611270
【申請號】CN201510062311
【發明人】盧志亮, 戴文莉, 劉曉華, 劉路路
【申請人】連云港恒奧達肥料科技有限公司
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月6日