基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種寡糖非還原胺化衍生化的方法，尤其是涉及一種基于含磷苯胺衍 生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，包括以含磷苯胺衍生物為衍生化試劑，在甲醇水混合 溶劑中使寡糖衍生化的反應。具體來講，所述方法使用還原性寡糖為寡糖原料，含磷苯胺衍 生物為衍生化試劑，在甲醇水混合溶劑中反應生成含磷苯胺衍生物衍生化的寡糖。
【背景技術】
[0002] 蛋白質的糖基化修飾是一種重要的翻譯后修飾，它參與、調控生命體的眾多生物 功能，比如說胚胎的發育、蛋白的折疊、細胞粘附、免疫響應等等。其生物功能的多樣性源于 寡糖的結構復雜性。因此，糖蛋白上寡糖結構的分析及鑒定對理解其生物功能具有非常重 要的意義。在諸多技術手段中，質譜技術因其快速、靈敏、樣品消耗量少等特點在寡糖結構 的分析、鑒定中發揮了越來越重要的作用。
[0003] 寡糖在質譜中的離子化效率較低，一直制約著質譜技術在糖檢測領域的發展，因 此一般需要對寡糖進行衍生化。傳統的還原胺化衍生化方法需要用到毒性高的還原試劑， 如硼氫化鈉，而且與下游的質譜檢測不兼容，需要繁瑣的分離純化步驟，容易造成樣品損 失。后來又發展了非還原胺化衍生化法，如利用3-氨基喹啉、2-氨基吡嗪及苯胺作為非還 原胺化衍生化試劑。
[0004] 研宄表明，磷酰基在ESI質譜分析中具有較強的增敏效應。將氨基酸氮端磷酰化 修飾后進行MALDI-MS檢測，發現磷酰基可以有效抑制低分子量區域的基質峰的干擾，增強 小分子氨基酸的MALDI質譜信號。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于結合苯胺與還原糖的非還原胺化反應及磷酰基在MALDI-MS中 的增敏效應，提供一種工藝較為簡單的基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方 法。
[0006] 本發明包括以下步驟：
[0007] 1)將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混合，水浴反應 后，利用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物對麥芽五糖的衍生化效果；
[0008] 2)以NA2、核糖核酸酶B上連接的寡糖及雞卵清蛋白上連接的寡糖為寡糖來源，考 察高分子量寡糖、復雜寡糖庫的衍生化效果及質譜增敏效應。
[0009] 在步驟1)中，所述將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混 合以麥芽五糖為模型；所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液可采用含有lmg/mL含磷 苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液，乙酸-甲醇溶液中乙酸與甲醇的體積比可為1:9;所述含 有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液的體積比可為1 : 1，所述麥芽五糖 水溶液的濃度可為100Ug/mL;所述水浴反應的條件可在75°C水浴反應3h;所述含磷苯胺 衍生物如表1所示。
[0010] 與現有的方法相比，本發明具有以下突出優點：
[0011] 1)可以廣泛應用到各種還原性寡糖及復雜寡糖庫；
[0012] 2) "一步衍生化"；
[0013] 3)操作簡單，無需純化；
[0014] 4)反應時間短（約3h);
[0015] 5)衍生化效率可達到95%以上；
[0016] 6)質譜中響應信號及信噪比提高約2?5倍。
【附圖說明】
[0017] 圖1是基于含磷苯胺衍生物作為非還原胺化衍生化試劑的寡糖衍生化方法反應 通式。
[0018] 圖2是在最佳條件下，未衍生化的麥芽五糖（A)及應用本方法衍生化的麥芽五糖 (B)的質譜圖。橫軸為質荷比（m/z)，縱軸為信號強度（Intensity)。
[0019] 圖3是在最佳條件下，未衍生化的NA2 (A)及應用本方法衍生化的NA2 (B)的質譜 圖。橫軸為質荷比（m/z)，縱軸為信號強度（Intensity)。
[0020] 圖4是在最佳條件下，來源于核糖核酸酶B的未衍生化的寡糖混合物（A)及 應用本方法衍生化的寡糖混合物（B)的質譜圖。橫軸為質荷比（m/z)，縱軸為信號強度 (Intensity)〇
[0021] 圖5是在條件下，來源于雞卵清蛋白的未衍生化的寡糖混合物（A)及應用本方法 衍生化的寡糖混合物（B)的質譜圖。橫軸為質荷比（m/z)，縱軸為信號強度（Intensity)。
【具體實施方式】
[0022] 本發明涉及一種寡糖的基于含磷苯胺衍生物的非還原胺化衍生化方法，以 4-DPPBA為例，其反應的通式如圖1所示。
[0023] 表1是本發明中所涉及的含磷苯胺衍生物分子結構式。圖2?5中所涉及的含磷 苯胺衍生物均以4-DPPBA為例加以說明。
[0024]表1
[0025]
【主權項】
1. 基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混合，水浴反應后，利 用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物對麥芽五糖的衍生化效果； 2) 以NA2、核糖核酸酶B上連接的寡糖及雞卵清蛋白上連接的寡糖為寡糖來源，考察高 分子量寡糖、復雜寡糖庫的衍生化效果及質譜增敏效應。
2. 如權利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混合以麥芽 五糖為模型。
3. 如權利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液采用含有lmg/mL含磷苯胺衍生 物的乙酸-甲醇溶液。
4. 如權利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，乙酸-甲醇溶液中乙酸與甲醇的體積比為1 : 9。
5. 如權利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液的體積比為 1 ： 1〇
6. 如權利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述麥芽五糖水溶液的濃度為100 μ g/mL。
7. 如權利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述水浴反應的條件是在75°C水浴反應3h。
8. 如權利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述含磷苯胺衍生物如表1所示。
【專利摘要】基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，涉及一種寡糖非還原胺化衍生化的方法。1)將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混合，水浴反應后，利用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物對麥芽五糖的衍生化效果；2)以NA2、核糖核酸酶B上連接的寡糖及雞卵清蛋白上連接的寡糖為寡糖來源，考察高分子量寡糖、復雜寡糖庫的衍生化效果及質譜增敏效應。1)可以廣泛應用到各種還原性寡糖及復雜寡糖庫；2)“一步衍生化”；3)操作簡單，無需純化；4)反應時間短(約3h)；5)衍生化效率可達到95％以上；6)質譜中響應信號及信噪比提高約2～5倍。
【IPC分類】C07F9-53, C07F9-40, C07H15-02, G01N27-64, C07H1-00
【公開號】CN104610387
【申請號】CN201510031319
【發明人】劉艷, 甘杰鵬, 袁航, 趙玉芬
【申請人】廈門大學
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月22日