一種恒溫快速擴增檢測單核細胞增生李斯特菌的方法
【專利說明】一種恒溫快速擴増檢測單核細胞増生李斯特菌的方法 所屬技術領域
[0001] 本發明屬于食品安全領域，具體涉及一種食品中單核細胞增生李斯特菌的檢測方 法。
【背景技術】
[0002] 單核細胞增生李斯特氏菌，簡稱"單增李斯特菌"，為一種革蘭氏陽性短小無芽胞 桿菌。李斯特菌屬有2個群共7個種，其中單核細胞增生李斯特菌是能引起人類疾病的一種 重要的食源性致病菌。單增李斯特菌在自然界分布廣泛，蔬菜、乳制品、海產品、肉類和禽類 等食品都已被證實是其傳播的載體，該菌的易感人群主要是孕婦、新生兒、老年人和免疫缺 陷者，感染后主要會引起李斯特菌病、敗血癥、腦膜炎和流產等，致死率高達20 %?50 %。 2〇〇〇年，世界衛生組織已將單增李斯特菌列為重點檢控的食源性致病菌之一。因此，建立快 速有效的檢測單增李斯特菌的方法變得尤為重要。
[0003] 目前已建立的單增李斯特菌的檢測方法主要包括微生物法、酶聯免疫吸收分析法 (ELISA)、酶聯熒光分析法（ELFA)、聚合酶鏈式反應（PCR)等。相關的PCR方法從分子水平 上檢測單增李斯特菌，具有較高的特異性和靈敏度，特別是實時熒光定量PCR法，可以實時 監測體系的反應過程，避免了實驗過程中EB等致癌物質的污染，因此在檢測方法中具有一 定的優勢。但是反應過程需要昂貴且復雜的儀器，檢測成本高，很難實現基層化，在應用范 圍上受到限制。
[0004] 最近，恒溫核酸擴增方法已日漸成熟，賴解旋酶DNA擴增技術（HDA)是由美國NEB 公司研宄人員Vincent等于2004年發明的一種新型核酸等溫擴增技術，該技術模擬體內 DNA在恒溫下進行復制的自然過程，在恒溫條件下利用生物復制系統的關鍵組分實現DNA 的體外擴增。HDA主要是利用解旋酶在恒溫下解開DNA雙鏈，同時DNA單鏈結合蛋白穩定解 開的單鏈為引物提供結合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補鏈。新合成的雙鏈在解旋 酶的作用下又解成單鏈，并作為下一輪合成的模板進入循環擴增反應，最終實現靶序列的 指數式增長，克服了傳統PCR需要依靠儀器反復升降溫來獲取單鏈模板的缺點。因此，有必 要建立一種基于實時熒光HDA方法快速檢測食品中單增李斯特菌單一致病菌的檢測方法。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在于提供一種實時熒光HDA方法快速檢測食品中單增李斯特菌。本發 明采用的技術方案為：選取hly基因作為檢測靶基因，自行設計特異性引物；建立實時熒光 HDA快速檢測單增李斯特菌的新方法；對標準單增李斯特菌菌株及其對照菌株進行活化、 增菌培養；熱裂解法提取各菌株基因組DNA;以各菌株基因組DNA為模板，以建立好的實時 熒光HDA為方法，進行恒溫核酸擴增，根據擴增曲線驗證實時熒光HDA方法的特異性、靈敏 度和最低檢測限，最后通過實際樣品的檢測來確定所建立方法的可行性。
[0006] 具體步驟為：
[0007] (1)引物設計
[0008] 以hly基因作為檢測靶基因，根據單增李斯特菌ATCC19115在GenBank中hly基 因的登錄號JN703919. 1，應用BatchPrimer3設計多對引物，篩選并合成實時熒光HDA的 引物對。篩選出的合適的引物對為：上游引物：TCAGTGAGGGGAAAATGCAAGAAG;下游引物： CAGCTTTGCCGAAAAATCTGGAAGG〇
[0009] (2)實時熒光HDA反應體系
[0010] 實時熒光HDA反應體系的體積比為：ddH20 50%，10XAnnealingbuffer10%， MgS044%，NaCl8%，dNTPSolution7%，上游引物 1.5%，下游引物 1.5%，DNA8%， EnzymeMix7%，EvaGreen(20X，Biotium)l%，ROXReferenceDye50X，2% 〇
[0011] (3)實時熒光HDA反應程序：
[0012] 65°C恒溫2min為一個循環，共計40個循環；熔解曲線階段根據遵循儀器設置，整 個反應過程在實時熒光定量核酸擴增儀上完成。
[0013] (4)菌株基因組DNA提取
[0014] 標準菌株分別購自美國典型菌種保藏中心（ATCC)和中國醫學細菌保藏管理中心 (CMCC)。除了單增李斯特菌以外的其他對照菌株分別是：格氏李斯特菌、英諾克李斯特菌、 產氣腸桿菌、福氏志后菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、賭樣芽孢桿 菌、阪崎腸桿菌。用熱裂解法分別提取各菌株基因組DNA。
[0015] (5)實時熒光HDA擴增
[0016] 以各菌株基因組DNA為模板，根據建立的實時熒光HDA反應體系，在引物的作用下 進行恒溫擴增，通過實時熒光定量核酸擴增儀對擴增過程進行實時監測。分別從引物特異 性、擴增方法靈敏度和最低檢測限三個方面驗證HDA擴增方法的可靠性。
[0017] 本發明與現有技術相比，其顯著優點是：
[0018] 1)實時熒光HDA反應過程簡單且可實時監控，只需要一個恒溫的環境和熒光檢測 體系即可，對反應條件的要求不高。
[0019] 2)采用優化的實時熒光HDA檢測法檢測單增李斯特菌，可以大大縮短檢測時間， 以達到快速檢測的目的。
[0020] 3)該方法對于食品中的單增李斯特菌簡單、靈敏、特異性高，樣品前處理簡單。
【附圖說明】
[0021] 附圖1為：賴解旋酶DNA擴增（HDA)檢測單增李斯特菌原理圖。附圖2為：單核 細胞增生李斯特菌引物特異性擴增圖：(a)實時熒光HDA擴增，（b)實時熒光PCR擴增。附 圖3為：單增李斯特菌純培養靈敏度擴增圖，（a)實時熒光HDA擴增，（b)實時熒光PCR擴 增。其中，⑴?⑵分別表示菌懸液濃度，依次是：1. 2X108、1. 2X107、1. 2X106、1. 2X105、 1. 2X104、1. 2X103、1. 2X102,單位CFU/mL。附圖4為：人工污染鮮肉中單增李斯特菌最低 檢測限擴增圖，（a)實時熒光HDA擴增，（b)實時熒光PCR擴增。其中，（1)?（4)分別表示 菌懸液濃度，依次是：1. 2X106、1. 2X105、1. 2X104、1. 2X103,單位CFU/mL。
【具體實施方式】
[0022] 結合實施例對本發明作進一步地描述：
[0023] (1)單增李斯特菌活化及增菌培養。在活化單增李斯特菌前配制好胰酪胨大豆酵 母浸膏瓊脂（TSA-YE) (1L):胰胨17g，多價胨3g，酵母膏粉6g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2. 5g， 葡萄糖2. 5g，瓊脂15g，最終pH7. 3±0. 2。121°C高壓滅菌15min，冷卻至46°C左右制成 平板，備用。將配套的單增李斯特菌復蘇液滴加到凍干菌種中，滴加量〇. 3mL左右，用無 菌滴管反復吹吸，至凍干菌種溶解成菌懸液為止；用接種環將單增李斯特菌菌懸液接種至 TSA-YE平板上，平板置于37°C恒溫培養箱倒置培養12h;配制腦-心浸出液肉湯（BHI)培 養基（1L):胰蛋白胨10g，氯化納5g，磷酸氫二鉀2. 5g，葡萄糖2g，牛心浸出液500mL，最終 pH7.4±0. 2。121°C高壓滅菌15min，冷卻至46°C左右備用；將生長良好的單增李斯特菌菌 落接種至BHI培養基種，搖瓶過夜培養，生長良好的菌懸液用于菌種DNA提取。活化及接種 過程在超凈工作臺無菌環境下進行。
[0024] (2)菌株基因組DNA提取。熱裂解法提取菌株DNA步驟：取lmL菌懸液于EP管中， 12000rpm離心lmin，棄上清；取500yL滅菌水吹打沉淀，12000rpm離心lmin，棄上清；重 復上一步驟；取100yL滅菌水吹打沉淀，沸水浴lOmin，12000rpm離心lmin;取上清至另一 EP管，-20°C保存備用。提取到的DNA用酶標儀檢測其0D值，判斷DNA的質量。
[0025] (3)實時熒光HDA法檢測單增李斯特菌。根據優化后的實時熒光HDA方法配制反 應混合液（不含DNA模板），短暫離心后分裝至PCR管中，分別向每個PCR管添加DNA模板， 完整的實時熒光HDA反應體系為25yL，高速離心2min后，置于熒光定量恒溫擴增儀中進行 實時熒光HDA擴增，擴增程序設置為：65°C2min為一個循環，共40個循環；熔解曲線階段根 據遵循儀器設置，根據擴增曲線及熔解曲線，分析檢測結果。反應混合液的配制及體系的分 裝都在超凈工作臺中進行。
[0026] (4)人工污染鮮肉中單增李斯特菌檢測。對試驗中用到的新鮮牛肉用國標（GB 4789. 30- 2010)的方法進行檢測，證明不含單增李斯特菌。將增菌培養的單增李斯特菌菌 懸液進行10倍梯度稀釋，對應的人工污染到牛肉中，具體操作：將市售牛肉進行攪拌，加少 些生理鹽水進行均質，稱取30g樣品加入到270mL生理鹽水中，混合均勻并分成10份，每等 份29mL，進行滅菌。把稀釋好的單增李斯特菌菌懸液各取lmL對應的污染到牛肉勻漿液中。 提取各梯度污染的肉勻漿DNA，以此作為模板進行實時熒光HDA和PCR試驗。
[0027] (5)結果顯示：單增李斯特菌純培養HDA方法的最低檢測限是1. 2X102CFU/mL， PCR方法的最低檢測限是1. 2X103CFU/mL，所以實時熒光HDA的檢測靈敏度要微高于實時 熒光PCR，且更易達到穩定期。HDA和PCR對人工污染鮮肉中單增李斯特菌檢測濃度均為 4X103CFU/mL，無顯著差異。
【主權項】
1. 一種實時熒光定量賴解旋酶恒溫核酸擴增（HDA)檢測單核細胞增生李斯特菌的檢 測方法，其特征在于：設計對單增李斯特菌具有特異性擴增功能的引物對序列，建立實時熒 光HDA檢測方法，以單核細胞增生李斯特菌基因組DNA為模板，進行特異性恒溫核酸擴增； 通過基因組DNA的恒溫擴增曲線及熔解曲線，分析檢測結果，快速檢測單核細胞增生李斯 特菌。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的對單核細胞增生李斯特菌有 特異性擴增的引物對序列分別是：上游引物：TCAGTGAGGGGAAAATGCAAGAAG ;下游引物： CAGCTTTGCCGAAAAATCTGGAAGG 〇
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的實時熒光HDA檢測方法中，引物終 濃度為 〇? 15 umol/L。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的實時熒光HDA反應體系中，熒光染 料為 EvaGreen。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核細胞增生李斯特菌基因組DNA 的提取方法可以是試劑盒法、傳統DNA抽提法（酚-氯仿法）、）離子螯合劑（Chelex-100) 抽提法、熱裂解法；優選熱裂解法。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的定量方法為實時熒光檢測，測得相 對熒光信號強度的對數log (ARn)與擴增循環數（Cycle)建立單核細胞增生李斯特菌的對 數曲線關系。
【專利摘要】本發明提供一種實時熒光定量賴解旋酶恒溫核酸擴增檢測單核細胞增生李斯特菌的方法。設計對單增李斯特菌具有特異性擴增功能的引物對序列，反應模擬體內DNA在恒溫下進行復制的自然過程，利用解旋酶在恒溫下解開DNA雙鏈，以單核細胞增生李斯特菌基因組DNA為模板，進行特異性恒溫核酸擴增，實現靶序列的指數式增長，建立實時熒光賴解旋酶恒溫核酸擴增檢測方法，通過基因組DNA的恒溫擴增曲線及熔解曲線，分析檢測結果，從而快速檢測單核細胞增生李斯特菌。該方法克服了傳統PCR需要依靠儀器反復升降溫來獲取單鏈模板的缺點，原理簡明，操作簡便，可快速、簡單、靈敏、特異的檢測食品中的單增李斯特菌。
【IPC分類】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-01
【公開號】CN104593516
【申請號】CN201510067614
【發明人】沈曉芳, 張明如, 丁洪流, 龐月紅
【申請人】江南大學
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年2月9日