一種區分克羅諾桿菌屬不同種的pcr-rflp分子分型方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品微生物檢驗技術領域，具體涉及一種區分克羅諾桿菌屬不同種的PCR-RFLP分子分型方法。
【背景技術】
[0002]克羅諾菌屬(CrofloAacier)，是重要食源性致病菌，屬腸桿菌科的革蘭氏陰性桿菌，能導致新生嬰幼兒腦膜炎、致死性結腸炎和菌血癥等，流行病數據調查表明嬰幼兒配方奶粉是其感染疾病的主要傳播媒介。目前，國內克羅諾菌屬的分型技術主要包括抗生素分型、■菌體分型、Enterobabcterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR),脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)、隨機擴增多態性(RandomApplied Polymorphic DNA-PCR)等技術，這些方法無法有效區分克羅諾菌屬不同的菌種，而盡管國際上多位點序列分析(Multilocus Sequenching Typing, MLST)能對克羅諾菌屬的不同種，但核酸純化、測序與分析等操作較繁瑣，耗時較長，不利于該菌在食品污染或流行病病原的快速診斷。因而，操作方便、快速地區分克羅諾菌屬不同種的分子分型方法對食品中克羅諾菌污染的鑒定及克羅諾菌感染疾病的快速鑒定均具有重要的理論和實際意義。
【發明內容】
[0003]為準確、快速鑒定克羅諾菌屬的不同菌種，達到對克羅諾菌污染食品和感染疾病病原的快速診斷，本發明提供一種用于區分克羅諾菌屬不同種的方便、快速和準確的分子分型方法。
[0004]—種區分克羅諾桿菌屬不同種的PCR-RFLP分子分型方法，選用rpoJ基因；用擴增引物 F: 5’ - ATGCAGGGTTCTGTGACAGAG -3’ ；R:5’ - GGTGGCCARTTTTCYAGGCGC-3’ 對 rpoJ基因擴增，再用限制性內切酶Tail酶切基因擴增產物。結果表明，四種克羅諾菌種均能擴增得到大小為968bp大小的目的片段，酶切結果顯示不同菌種獲得不同的酶切圖譜。
[0005]所述/770J基編碼RNA聚合酶-α亞單位。
[0006]擴增片段大小為968bp，rpW基因的擴增條件是:PCR擴增在PCR儀上進行，反應體系:引物(10 mmol/L)0.5-1 μ?，DNA模板5-lOng，20-25 mmol/L Tris-HCl,80-100 mmol/L KCK2.5-3.0 mmol/L MgCl2),加無菌雙蒸水至50 PL。反應條件:94 °C預變性5 min ；94 °C變性 30 s，56-58 °C退火 45-60 s，72°C延伸 50-60 s，35 個循環；72 0ClO min。
[0007]酶切條件基因PCR擴增產物10μ?，無核酸酶無菌水18μ?，I Xbuffer 2μ?(1mM Tris-HCl (ρΗ7.4)，2.5-5mM MgCl2, 80-100mM NaCl, 0.1-0.2mg/mL小牛血清白蛋白)，Tail限制性內切酶1-2μ?, 60_65oC孵育l_4h。
[0008]本發明具有以下方面的優點:
1、rpM基因具有較好的保守性基因在克羅諾桿菌屬中不同菌基因組中均存在，并且不同菌種之間酶切位點存在差異；
2、Tail單酶切反應
本發明只使用一種限制性內切酶Tail對rpM基因進行酶切，避免RFLP分型技術中雙酶切帶來的酶切條件差異及其酶活性減弱等問題。采用Tail單酶切反應，不僅實驗操作方便、快速，而且酶切反應徹底、干擾少。
【附圖說明】
[0009]圖1為克羅諾桿菌屬四種不同種的rpoJ基因片段圖。
[0010]圖2為克羅諾桿菌屬四種不同種的Tail酶切基因的RFLP多態性圖譜。
【具體實施方式】
[0011]下面結合實施例，對本發明作進一步地說明。
實施例
[0012]一種區分克羅諾桿菌屬不同種的PCR-RFLP分子分型方法為兩個實驗階段，第一階段為圖1所示，擴增基因片段，第二階段如圖2所示，采用Tail酶切第一階段擴增的基因片段，獲得不同的酶切圖譜，進而區分克羅諾菌屬四種不同菌種。
[0013]具體操作步驟如下:
(1)選用rpoJ基因
/77(0^基編碼RNA聚合酶-α亞單位；
(2)對rpoJ基因擴增
用擴增引物 F:5’ - ATGCAGGGTTCTGTGACAGAG _3’；R:5’ - GGTGGCCARTTTTCYAGGCGC-3’對基因擴增，得到克羅諾菌屬四種不同菌的基因片段，見圖1:克羅諾菌屬四種不同菌種的菌株巧W擴增結果；圖1中M (孔道M):DL2000分子量標記物(lOObp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp) ;lane25 (孔道 25): C.sakazakii ATCC29544 (阪崎克羅諾菌 ATCC29544) ; lane26 (孔道 26): C.muytjensii (莫金斯克羅諾菌)ATCC51329;lane7: C.dublinnensis (都柏林克羅諾菌)；lane8, 28, 31, 32, 37, 52 and 57 (孔道 8，28，31，32，52，57): C.malonaticus (丙二酸鹽克羅諾菌);0ther lanes (其他孔道):C.sakazakii (阪崎克羅諾菌)；
擴增片段大小為968bp，基因的擴增條件是:PCR擴增在PCR儀上進行，反應體系:引物(10 mmol/L) 0.5-1 μ?, DNA 模板 5-lOng，20-25 mmol/L Tris-HCl,80-100 mmol/L KCK2.5-3.0 mmol/L MgCl2),加無菌雙蒸水至50 PL。反應條件:94 °C預變性5 min ；94 °C變性 30 s，56-58 °C退火 45-60 s，72°C延伸 50-60 s，35 個循環；72 0ClO min ；
(3)Tail單酶切反應
采用Tail限制性內切酶對擴增的四種不同菌的基因片段分別進行單酶切，
區分克羅諾桿菌屬4種不同種RFLP酶切多態性的Tail酶切條件基因PCR擴增產物 10μ?，無核酸酶無菌水 16μ?，IXbuffer 3PL(10mM Tris-HCl (ρΗ7.4)，2.5-5mMMgCl2, 80-100mM NaCl, 0.1-0.2mg/mL 小牛血清蛋白)，Tail 限制性內切酶 1~2μ?,60-65°C 孵育 l-4ho
[0014]獲得克羅諾菌屬四種不同菌的差異性PCR-RFLP指紋圖譜，進而為比對區分克羅諾菌屬的不同菌種奠定基礎。見圖2:克羅諾菌屬四種不同菌種rpM基因的Tail酶切結果，圖 2 中:M(孔道 M):DL2000 分子量標記物(10bp，250bp，500bp，750bp，100bp，2000bp)；lane25 (孔道 25): C.sakazakii ATCC29544 (阪崎克羅諾菌 ATCC29544) ; lane26 (孔道26): C.muytJensii (莫金斯克羅諾菌)ATCC51329; lane7: C.(都柏林克羅諾菌)；lane8, 28, 31, 32, 37, 52 and 57 (孔道 8，28，31，32，52，57): C.malonaticus(丙二酸鹽克羅諾菌);Other lanes (其他孔道):C.sakazakii (阪崎克羅諾菌)。
【主權項】
1.一種區分克羅諾桿菌屬不同種的PCR-RFLP分子分型方法，其特征在于:選用rpoA基因；用擴增引物F:5’_ ATGCAGGGTTCTGTGACAGAG -3’;R:5’- GGTGGCCARTTTTCYAGGCGC-3’對基因擴增，得到克羅諾菌屬四種不同菌的基因片段，然后采用Tail限制性內切酶對擴增的四種不同菌的基因片段分別進行酶切，獲得克羅諾菌屬四種不同菌的差異性PCR-RFLP指紋圖譜，進而為比對區分克羅諾菌屬的不同菌種奠定基礎。
2.根據權利要求1所述的一種區分克羅諾桿菌屬不同種的PCR-RFLP分子分型方法，其特征在于:所述/77(0^基編碼RNA聚合酶-α亞單位。
3.根據權利要求1所述的一種區分克羅諾桿菌屬不同種的PCR-RFLP分子分型方法，其特征在于:擴增片段大小為968bp，rpW基因的擴增條件是:PCR擴增在PCR儀上進行，反應體系:終濃度為 10 mmol/L 引物 0.5-1 μ?，DNA 模板 5-lOng，20-25 mmol/L Tris-HCl,80-100 mmol/L KC1>2.5-3.0 mmol/L MgCl2，加無菌雙蒸水至 50 M-L ； 反應條件:94 °C預變性5 min ；94 °C變性30 S，56-58 °C退火45-60 s，72°C延伸50-60 S，35 個循環；72 0ClO min。
4.根據權利要求1所述的一種區分克羅諾桿菌屬不同種的PCR-RFLP分子分型方法，其特征在于:酶切條件:i77oJ基因PCR擴增產物?ομ?，無核酸酶無菌水18μ?，I Xbuffer2μ?:1mMTris-HCl ρΗ7.4、2.5_5mM MgCl2、80_100mM NaCl、0.1-0.2mg/mL 小牛血清白蛋白；Tail限制性內切酶1-2μ?, 60_65°C孵育l_4h。
【專利摘要】本發明涉及一種區分克羅諾桿菌屬不同種的PCR-RFLP分子分型方法。以rpoA基因為對象，通過特異性引物擴增得到克羅諾菌屬四種不同菌的rpoA基因片段，然后采用TaiI限制性內切酶對擴增的rpoA基因片段進行單酶切，獲得克羅諾菌屬四種不同菌的差異性PCR-RFLP指紋圖譜，進而區分克羅諾菌屬不同菌種。通過大量克羅諾菌屬的菌株事例驗證，該分子分型方法能有效獲得不同種差異性的酶切多態性圖譜，快速、準確區分克羅諾菌屬四種不同菌。本發明適用于區分克羅諾菌屬的菌種，對食品中克羅諾菌的準確鑒定及病原的快速診斷具有重要意義。
【IPC分類】C12Q1-04, C12R1-01, C12Q1-68
【公開號】CN104593487
【申請號】CN201410770092
【發明人】葉應旺, 凌娜, 焦芮, 韓永佳, 高吉娜
【申請人】合肥工業大學
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月15日