一種利用果膠酶裂解高酯化度果膠制備單糖和低聚半乳糖醛酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于功能有機物制備技術領域，特別涉及利用產果膠酶的畢赤酵母發酵產 生的酶裂解高酯化度果膠產生單糖和低聚半乳糖醛酸的方法。
【背景技術】
[0002] 果膠（pectin)以原果膠、果膠酸的形式廣泛分布在植物果實的根、莖、葉之中，具 有天然、綠色、營養、健康等特征，是經過聯合國糧食及農業組織及世界衛生組織（FAO/WHO) 聯合專家委員會共同認同的無毒、無ADI(每日允許攝入量）限制的食品配料。目前，果膠 作為增稠劑、穩定劑、凝膠劑和增效劑等被廣泛用于食品工業。此外，果膠還可用于保健食 品和藥品。果膠具有降低血糖預防糖尿病、降低膽固醇、防止結腸癌和前列腺癌、防止肥胖 以及抑制腸內病原菌增殖的作用，因此可以用于制作防止糖尿病、肥胖癥、高血脂等疾病的 保健食品。在醫藥行業，果膠還具有抗菌、止血、降血脂以及抗輻射等作用，可單獨或與其它 制劑合用配制軟膏，栓劑和微囊等藥物制劑，被稱為"人體健康的平衡素"。
[0003] 然而，果膠由于其分子量太大而限制了其生物學功能等多方面的應用。此外，不同 來源、原料種類、生長環境以及季節的不同也使其結構上不同，也決定了其在功能特性上的 不同，也限制了其在商業上的應用，因此對果膠進行改性成了一個研宄熱點。通過降解果膠 能得到大量的低聚半乳糖醛酸，目前理論的降解途徑有物理降解法、化學降解法和酶降解 法。雖然用物理法（如張麗芬，果膠多糖超聲波定向降解途徑及其機理研宄，浙江大學博士 生學位論文，2013)、化學法（酸法降解果膠）也能使其裂解，但是，物理和化學方法存在產 物不穩定、污染環境等問題。用酶降解則不存在上述問題，果膠酶是能夠分解果膠物質的多 種酶的總稱（薛長湖，張永勤，李兆杰，李志軍，果膠及果膠酶的研宄進展，食品與生物技術 學報，2005年06期），用酶降解果膠進行麻類脫膠，果汁澄清已有很多研宄，如魏娟等，果膠 酶對早酥梨汁的澄清試驗研宄，安徽農學通報；又如趙欣，林盼，復配生物酶對亞麻粗紗處 理工藝的研宄。但是這些研宄的目的不是為了制備低聚半乳糖醛酸。錢麗麗在其碩士學位 論文（果膠裂解酶的發酵及其在制備不飽和低聚半乳糖醛酸的應用，浙江工業大學碩士學 位論文，2007年6月）中報道了利用果膠裂解酶制備低聚半乳糖醛酸，但是其酶的利用效率 不高，每100U的酶24小時只能處理2g果膠而且酶解以后沒能得到單糖和二糖等聚合度低 的糖。
[0004] 半乳糖醛酸是果膠組成的一個單糖單位，目前尚沒有利用酶法獲得這種單體的方 法。果膠作為一種多糖，一般的果膠酶水解果膠得到低聚半乳糖醛酸（2-10個單糖），如 HuilinWang,Characterizationandhigh-levelexpressionofametagenome-derived alkalinepectatelyaseinrecombinantEscherichiacoli，ProcessBiochemistry， 2014,利用果膠酶水解產物是二糖到四糖。如果要獲得單糖，尚需要利用二糖水解酶進一 步水解才能獲得單糖。低聚糖的概念是1930年由B.Helgerich等提出來的，是由2?10 個單糖構成的直鏈或支鏈低度聚合糖。它是自然界中一類具有多種特殊生物功能的有機化 合物，分布特別廣泛，而且種類繁多，在糖生物學功能中占有相當大的比重。低聚糖包括兩 大類，即天然低聚糖和功能性低聚糖，低聚半乳糖醛酸屬于功能性低聚糖，因為在人體胃 腸道內部缺少分解功能性低聚糖的酶系統，同時它也不能被人體酸、胃酶所降解，會直接進 入到大腸內優先被雙歧桿菌利用，是性能優良的增殖雙歧桿菌的因子。功能性低聚糖也具 有糖類的一些特性，可替代糖料作為甜食的佐料。低聚半乳糖醛酸具有促進腸道雙歧桿菌 大量增殖，調節植物生長發育，抗癌，降低膽固醇，抑制脂肪肝等作用（錢麗麗，果膠裂解酶 的發酵及其在制備不飽和低聚半乳糖醛酸的應用，浙江工業大學碩士學位論文，2007年6 月），因此，其應用潛力巨大。
[0005] 本發明利用專利（專利號ZL201110379664.X) "一種堿性果膠酶pell68s核苷酸 優化序列及其高效表達"中所涉及的菌株GS115/pell68s-9k，進行發酵產酶，并對食品級果 膠進行酶解條件摸索，探索出了制備單糖和低聚半乳糖醛酸的條件。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提出利用畢赤酵母發酵產生的果膠酶具有高酶活，并可快速高效 的降解果膠的特點，提供了一種制備單糖和低聚半乳糖醛酸的方法。
[0007] 為了實現本發明的目的，發明人通過大量試驗研宄和不懈探索，最終獲得了如下 技術方案：
[0008] 一種利用果膠酶裂解高酯化度果膠制備單糖和低聚半乳糖醛酸的方法，該方法包 括如下步驟：
[0009] (1)發酵培養GS115/pell68s-9k菌種制備果膠酶液；
[0010] ⑵將2g大于70%酯化度的果膠溶于100mlpH9. 4的果膠酶緩沖液中，調節pH至8. 8-9. 2,水浴預熱至50°C后，加入步驟（1)制備、酶活100-120U的果膠酶液，在50°C條 件下反應2h，反應過程中不斷攪拌，并在反應后的前lOmin中內每5min補充4g果膠，通過 調節使整個反應中的pH= 8. 8-9. 2,得酶解液；
[0011] (3)將步驟⑵制備的酶解液在3000rpm條件下離心lOmin，取上清液，在65°C的 干燥箱中蒸發干燥得到低聚半乳糖醛酸。
[0012] 優選地，如上所述的利用果膠酶裂解果膠制備單糖和低聚半乳糖醛酸的方法，其 中步驟（2)中所述的果膠酶緩沖液按如下方法配制：稱取CaCl20.021g，甘氨酸1.08775g， NaOHO. 35g，用去離子水溶解后并定容到500ml。
[0013] 進一步優選地，如上所述的利用果膠酶裂解果膠制備單糖和低聚半乳糖醛酸的 方法，其中步驟（1)將活化的GS115/pell68s-9k菌種接種于液體BMGY培養基，在28°C、 220rpm的條件下搖瓶培養2d，將發酵好的菌液轉入無菌離心管中，3000rpm離心lOmin，倒 掉上清，向離心管中加入約占離心管容積三分之一的無菌水，吹打離心管底的菌體使其重 懸，3000rpm離心10min，倒掉上清，向離心管中加入約占離心管容積三分之一的液體BMMY 培養基，吹打離心管底的菌體使其重懸，然后將菌懸液轉入液體BMMY培養基中，再加入甲 醇至終濃度為1 %，在28°C、220rpm的條件下搖瓶培養4d，培養期間，每天定時加入甲醇至 終濃度為1 %，培養到第5天的時候將菌液轉入離心管中，3000rpm離心10min，取上清，即為 果膠酶液。
[0014] 本發明的工藝步驟為果膠酶的發酵、底物的酶解、離心、產物分析等過程。具體工 藝步驟如下：
[0015] 1、將GS115/pell68s-9k菌種在固體YPD(葡萄糖2. 0g，蛋白胨2. 0g，酵母提取 物1. 〇g，瓊脂1. 5g，蒸餾水100ml)平板上劃線，使其活化；從上述YPD平板中挑選單菌落 接種于250mL錐形瓶中，瓶內含50ml液體BMGY(酵母提取物1. 0g蛋白胨2. 0g，酵母氮源 (YNB)0. 34g，硫酸銨1. 0g，pH6. 0磷酸緩沖液10ml，甘油10ml，水100ml)培養基，放入搖床， 在28°C、220rpm的條件下培養2d，在無菌操作臺上將發酵好的菌液轉入滅過菌的無菌離心 管中，貼好封口膠帶，配平，在離心機中在3000rpm條件下離心10min，在無菌操作臺上將離 心后的上清倒掉，向離心管中加入約占離心管容積三分之一的無菌水，用槍吹離心管底的 菌體，使其重懸，貼好封口膠帶，配平，在離心機中在3000rpm條件下離心10min，在無菌操 作臺上將離心后的上清倒掉，向離心管中加入約占離心管容積三分之一的液體BMMY(酵母 提取物1. 〇g，蛋白胨2. 0g，酵母氮源（YNB)0. 34g，硫酸銨1. 0g，pH6. 0磷酸緩沖液10ml，水 100ml)培養基，用槍吹離心管底的菌體，使其重懸，然后將菌懸液在250ml錐形瓶中用液體 BMMY培養基定容至50ml的，再加入500y1甲醇，放入搖床，在28°C、220rpm的條件下培養 4d，培養期間，每天定時加入500y1甲醇。培養到第5天的時候將菌液轉入離心管中，配平， 在離心機中在3000rpm條件下離心10min，取上清，此即為酶液，放入4°C冰箱保存備用。
[0016] 2、果膠酶酶活力測定。反應體系中包括粗酶稀釋液取20y1，加入0. 2%聚半乳糖 醛酸溶液2ml啟動酶促反應：反應條件為50°C反應15min，用3ml0. 03mol/L的磷酸終止反 應，用酶標儀在235nm處測其吸光度值。空白對照為無活性的酶液反應（S卩：先加3ml磷酸 與待測酶液混勻，再加入底物反應15min)。取酶液，用A235法測其酶活。
[0017]
【主權項】
1. 一種利用果膠酶裂解高酯化度果膠制備單糖和低聚半乳糖醛酸的方法，其特征在于 該方法包括如下步驟： ⑴發酵培養GS115/pell68s-9k菌種制備果膠酶液； (2) 將2g果膠溶于100ml pH9. 4的果膠酶緩沖液中，調節pH至8. 8-9. 2,水浴預熱至 50°C后，加入步驟（1)制備的酶活100-120U的果膠酶液，在50°C條件下反應2h，反應過程 中不斷攪拌，并在反應后的前l〇min中內每5min補充4g果膠，通過調節使整個反應中的pH =8.8-9. 2,得酶解液； (3) 將步驟（2)制備的酶解液在3000rpm條件下離心lOmin，取上清液，蒸發烘干得到 單糖和低聚半乳糖醛酸固體〇. 74克，果膠的水解率達到93%。
2. 根據權利要求1所述的利用果膠酶裂解高酯化度果膠制備單糖和低聚半乳糖醛酸 的方法，酶解液在3000rpm條件下離心lOmin，取上清液進行液相質譜檢測，顯示水解產物 為單糖和二糖到七糖的低聚半乳糖醛酸，其中以單糖到五糖為主，單糖峰值達到1〇 5,二糖 到五糖達到1〇4。 3. GS115/pell68s-9k菌種在制備能水解高酯化度果膠并產生單糖和低聚半乳糖醛酸 的果膠酶中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種利用果膠酶裂解高酯化度果膠制備單糖和低聚半乳糖醛酸的方法，該方法包括如下步驟：(1)發酵培養GS115/pel168s-9k菌種制備果膠酶液；(2)將10克果膠溶于pH9.4的緩沖液中，調節pH至8.8-9.2，水浴預熱至50℃后，加入110U的果膠酶液反應2小時，得酶解液；(3)將步驟(2)制備的酶解液離心，取上清液蒸發干燥得到單糖和低聚半乳糖醛酸，計算水解率可以達到93％。本發明具有工藝簡單、成本低、酶水解效率高的優點。
【IPC分類】C12P19-02, C12P19-00, C12N9-88, C12N9-26, C12N9-18, C12P19-14, C12R1-84
【公開號】CN104593450
【申請號】CN201510037006
【發明人】張桂敏, 龍光林, 馬延和
【申請人】湖北大學
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月26日