大麥Hvsusiba2基因在降低水稻田甲烷釋放的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及尤麥々KSMi知2基因在降低水稻田甲烷釋放的應用，具體為一個大麥 轉錄因子提高降低水稻甲烷釋放量方面的應用。
【背景技術】
[0002] 甲燒（CH4)是重要的溫室氣體之一，其排放的總量雖然不及C02，但其高于C02 21-25倍的增熱效率使其產生的溫室效應倍受關注。研究顯示：水稻田是大氣014的重要排 放源，約占全球人為總排放的12%_26%。中國是水稻種植大國，近20年平均種植面積和產量 分別占全球的20%和31%。水稻田甲烷釋放對溫室效應的影響受到多方關注，在1987-2011 年間，僅中文期刊發表的有關文獻超過200篇，從不同角度研究水稻田甲烷釋放的影響因 素。
[0003] 稻田甲烷生成的底物碳是來源于水稻光合作用產物，光合產物向根部轉運，分解 為二氧化碳、氫、甲酸、乙酸等甲烷生物合成的底物，在稻田復雜的植物和微生物互作過程 中，淹水環境促進了微生物的厭氧發酵，這些微生物利用水稻生長過程中向土壤釋放的碳 源，經過一系列分解作用，最后生成甲烷。向大氣排放的甲烷是土壤中厭氧微環境甲烷還原 過程和有氧微環境甲烷消耗過程的平衡后的凈值。
[0004] 稻田甲烷釋放的直接原因是微生物、土壤微環境以及作物品種互作的結果。所有 影響微生物、土壤環境以及作物品種的因素都能間接地影響稻田甲烷的生產和釋放。因此， 稻田甲烷的釋放是極其復雜的多因素綜合作用的結果。多年來，研究者們采用了許多策略 降低稻田甲烷釋放量，如拷田、更換品種、改變施肥方式等，但收效有限，且無法大面積推廣 使用。降低稻田甲烷釋放已成為全世界關注的熱點和難點。以改變水稻品種為切入點是從 源頭上減低甲烷產生和釋放的最經濟、最有效的方法。現代分子生物學技術可以通過分子 操作手段到達修飾植物的目的，如敲除基因刪除生物的不利性狀，插入整合一個片段增加 生物沒有的新性狀，還可以通過大片段整合或替代，將整個代謝途徑轉移到原來沒有的生 物中。本發明通過轉基因技術調控水稻體內碳分布方式，增加植株地上部的光合同化碳分 配，降低植株地下部的光合同化碳分配，達到提高產量，降低稻田甲烷釋放的目的。為通過 分子操作改良作物品種提供了新的思路。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供尤麥你知2基因在降低水稻田甲烷釋放的應用，構建 了植物載體P必在水稻籽粒中異源表達知連因；轉基因水稻甲烷 釋放量顯著下降。本研究結果對降低水稻的甲烷釋放，減少溫室效應具有及其重要意義。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 大麥"KSMi知連因在降低水稻田甲烷釋放的應用。通過在水稻籽粒中異源表達大麥WRKY轉錄因子基因現。
[0007] -種過表達//KsysiAa?因的載體。所述載體為啟動子驅動的 基因序列的pieJJ/?- 體。
[0008] -種降低水稻甲烷釋放量的方法，通過在水稻籽粒中異源表達々Kski知續現。
[0009] 所述知連因，基因編號為AY323206. 1，基因全長2354bp，其中編碼區 1722bp，編碼573個氨基酸，基因序列如SQEIDNO. 1所示。
[0010] 所述異源表達是構建特異性植物表達載體p 其構建過程 是：用歷II和 5^1 分別雙酶切中間載體pGEM-3Z-5^<9iT6和pl301 -ubiquitin，"^收pGEM-3Z-5^<9iT^中的啟動子，用啟動子替代pl301_ 中的 得到pl301-5^<9i7^中間載體；再用 5)9(91 酶切pl301-5^<9i76,用//ifloIII和Aal雙酶切pMOSBLlue載體上的知連因片段，回收后分別補平，將pMOSBLlue中 的//Ksisi知正向連接到p13 01 -仰知/功的后面，獲得psAeJJ/?- Aa么將轉化載體 導入農桿菌菌株LBA4404,獲得p LBA4404工程菌。
[0011] 所述水稻籽粒中異源表達//Ksisiha?因是借助農桿菌介導法獲得轉 基因水稻；通過自交分離篩選獲得表達大麥//KSki知連因的純合株系。
[0012] 轉化包括以下步驟： 1) 種子消毒和愈傷誘導 2) 工程菌 制備 3) 侵染及共培養 4) 抗性愈傷篩選 5) 抗性愈傷分化、幼苗生根。
[0013] 轉基因小苗移栽、檢測、篩選出知連因整合且在籽粒中表達的株系，通過 自交重組及進一步的分子檢測和篩選，獲得轉基因純合株系。
[0014] 本發明構建了pie/JA-達載體，在水稻籽粒中異源表達 基因，轉基因水稻地上部生物量顯著增加，地下部生物量顯著減少；穗長和穗粒數顯著增 力口；抽穗期甲烷釋放量比對照下降約3倍，花后28天甲烷釋放量比對照下約10倍。
[0015] 本發明的有益效果如下： 1.本發明提供了一種因的在降低水稻甲烷釋放的新應用方法。發明人 將轉基因技術與稻田生態研究技術結合，獲得籽粒特異性表達大麥轉錄因子知攻R 稻；轉基因水稻抽穗期甲烷釋放量比對照下降約3倍，花后28天甲烷釋放量下降約10倍。 本發明對于降低水稻田的甲烷釋放量，減少稻田的溫室效應具有極其重要的意義。
[0016] 2.本發明通過在水稻籽粒中特異性表達大麥轉錄因子//Ksisiha么改變了水稻生 物量，地上部生物量顯著增加，地下部生物量顯著下降。平均穗粒數顯著增多，籽粒中淀粉 含量提高。本發明通過增加光合產物向穗部分配，減少光合產物向地下部運輸，提高水稻產 量，降低甲烷釋放。
[0017] 3.本發明通過轉基因調控水稻體內碳分布方式，達到提高產量，降低稻田甲烷釋 放的目的，為通過分子操作改良作物品種提供了新的思路。
【附圖說明】
[0018]圖1. pieiT^-體不意圖。
[0019] 圖2.轉因水稻結實期植株表型。其中A為非轉基因對照水稻，B為 轉基因水稻； 圖3. 2個轉基因水稻外源基因插入拷貝數分析。
[0020] 圖4.轉基因水稻部分農藝性狀分析。
[0021] 圖5.轉知連因水稻地上部與地下部生物量。
[0022] 圖6.轉知連因水稻田甲烷釋放量測定。
【具