運用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及到生物制藥領域，具體涉及運用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽的方法。
【背景技術】
[0002]抗腫瘤19肽為腫瘤抑素(tumstatin)靠近C端的185 — 203位氨基酸，具有直接抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡的作用。當Tumstatinl85 — 203作為Tumstatin整體中的一個部分時，就失去了抑制腫瘤細胞增殖的功能，只有在切去該肽段其他多余的片斷時，它的作用才能表現出來。
[0003]抗腫瘤19肽含有α 3鏈特有的3聯體氨基酸序列SNS，可以抑制多形核白血病細胞活化，促進多種腫瘤細胞的黏附和趨化作用，同時能抑制腫瘤細胞的增殖。Shahan等的研宄表明，接近c端185 - 203位氨基酸組成的19肽可抑制黑色素瘤細胞和其他上皮腫瘤細胞以及多形核白血病細胞的生長。
[0004]其具有突出的抑制毛細血管內皮細胞增殖、誘導內皮細胞凋亡和特異性抑制血管生成的活性，進而抑制腫瘤生長，因此把該功能命名為腫瘤抑素。19肽具有較強的直接抗腫瘤活性，有可能成為腫瘤治療的一種新的有前景的藥物。
[0005]腫瘤抑素活性肽分子量小、使用安全、易提取、純化。研宄發現腫瘤抑素抗腫瘤細胞生長活性區位于19個氨基酸，分子量較小，可以合成這段肽基因序列，通過在原核細胞中大量表達，優化表達條件，得到所需要的大量蛋白，應用到腫瘤治療中。小分子多肽可以降低對機體的毒副作用和過敏反應，通過原核表達容易獲得。
[0006]腫瘤抑素作為肺一腎出血綜合癥自身抗原可能對腎、肺和機體的其它器官造成一定的損害，早期的研宄限于對腎一肺出血綜合征的診斷和治療，腫瘤抑素對腫瘤抑制作用的發現又賦予了其新的價值，研宄表明腫瘤抑素的抗原表位位于N端的40個氨基酸，這段序列沒有抗腫瘤作用。而19肽(185 — 203)的活性區去除了這部分無意義序列，降低了其對機體的副作用，卻不影響本身的抗腫瘤活性。可以直接抑制腫瘤細胞增殖和轉移，促進腫瘤細胞的凋亡。它具有傳統藥物的直接作用于腫瘤細胞本身。是一種廣譜，低毒，無毒副作用、無耐藥性內源性抗腫瘤的藥物，為腫瘤治療提供了更為廣闊的前景。而目前的工藝方法來生產重組的抗腫瘤19肽存在產量小，效率低，成本高，不穩定等缺點。
【發明內容】
[0007]針對以上存在的問題，本發明的目的在于提供一種運用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽的方法，本方法生產重組的抗腫瘤19肽產量大，效率高，成本低，生產過程穩定。
[0008]本發明采用的技術方案如下:
[0009]一種運用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽的方法，其特征在于，包括以下三個步驟:
[0010]I)將人工合成腫瘤抑素中185 - 203位氨基酸(19肽)所對應的核苷酸序列，連接至融合蛋白表達載體上；
[0011]2)經過進一步酶切和測序鑒定后，轉化到大腸桿菌中進行誘導表達得到融合蛋白；
[0012]3)表達的融合蛋白經幾丁質親和層析、二硫蘇糖醇(DTT)的柱內還原，可以直接獲得抗腫瘤19肽。
[0013]所述步驟I中表達載體為pet32a。
[0014]所述步驟2中大腸桿菌種類為BL21(DE3)plysS、BL21(DE3)、BL21 和 Rosetta(DE3)中的至少一種，所述誘導表達的誘導劑為乳糖和IPTG中的至少一種，培養基的pH為5 — 9，接種量為I 一 10%，誘導劑的濃度0.05 - 0.5mmol/L，誘導劑添加時間006(|(|為0.5 — 1.0，誘導溫度為20 - 70°C，誘導時間2 -1Oho
[0015]本發明的原理如下:
[0016]大腸桿菌是外源蛋白的表達系統中最經典的表達系統，而且是人們了解最透徹的表達系統，并且具有很多優點:成本低，表達量高，繁殖快，易存活，容易操作，抗污染性強，遺傳背景清楚，穩定性好，產物易純化，適應性強，它的這些特性也使它成為高效表達異源蛋白的最常用原核表達系統。大腸桿菌表達系統在基礎研宄和商業生產重組蛋白質上是強有力的工具。
[0017]大腸桿菌表達系統是人類了解最深、應用最為廣泛的表達系統。它具有發酵時間短和高效合成基因產物的特點。因為大腸桿菌易于操作、發酵成本低、遺傳背景清楚等優點，進而成為了外源基因表達的首選。
[0018]大腸桿菌是最經典的原核表達系統，并且是基因表達中的重要工具，具有很多優占.V.
[0019](I)研宄者已經對大腸桿菌的遺傳背景和基因表達調控機理研宄的非常透徹。
[0020](2)大腸桿菌的繁殖能力特別強，20min左右就能繁殖一代，從而縮短了發酵時間，利于大規模發酵，而且生產成本低廉。
[0021](3)大腸桿菌表達系統包含有多種宿主菌和載體，可以根據重組蛋白的表達需求進行選擇，并且進行最適的搭配。
[0022](4)表達量一般較真核表達系統高，并且下游的工藝比較簡單，利于生產，節省了下游的成本。
[0023]4)將合成的抗腫瘤19肽基因連接到表達載體pet32a上，即表達載體pet32a —19肽分別轉化到四種大腸桿菌BL21 (DE3)plysS、BL21 (DE3)、BL21和Rosetta (DE3)感受態細胞中，用誘導劑進行誘導表達重組蛋白，將誘導表達出的菌體進行SDS - PAGE蛋白電泳檢測，并運用Gel quant Express軟件分析凝膠電泳結果，篩選出表達量最高的菌株作為工程菌，對工程菌株進行質粒穩定性進行驗證。表達的融合蛋白經幾丁質親和層析、二硫蘇糖醇(DTT)的柱內還原，可以直接獲得抗腫瘤19肽。利用MTT的方法對重組蛋白進行抗腫瘤能力的研宄。
[0024]本發明的有益效果是:利用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽產量大，效率高，成本低，生產過程穩定。
【具體實施方式】
[0025]實施例1
[0026]將人工合成腫瘤抑素中185 - 203位氨基酸(19肽)所對應的核苷酸序列，連接至融合蛋白表達載體pet32a上；經過進一步酶切和測序鑒定后，轉化到BL21 (DE3)plysS大腸桿菌中進行誘導表達得到融合蛋白；誘導劑為乳糖，培養基的PH為6.5，接種量為2.1%,誘導劑的濃度0.lmmol/L,誘導劑添加時間0D_為0.7，誘導溫度為50°C，誘導時間5h，表達的融合蛋白經幾丁質親和層析、二硫蘇糖醇(DTT)的柱內還原，可以直接獲得抗腫瘤19肽。蛋白的表達量高達54.57mg/L，復性后的重組蛋白對腫瘤細胞的抑制率為70%。
[0027]實施例2
[0028]將人工合成腫瘤抑素中185 - 203位氨基酸(19肽)所對應的核苷酸序列，連接至融合蛋白表達載體pet32a上；經過進一步酶切和測序鑒定后，轉化到BL21 (DE3)大腸桿菌中進行誘導表達得到融合蛋白；誘導劑為IPTG，培養基的pH為6.5，接種量為2.1 %，誘導劑的濃度0.lmmol/L，誘導劑添加時間0D_為0.7，誘導溫度為40°C，誘導時間3h，表達的融合蛋白經幾丁質親和層析、二硫蘇糖醇(DTT)的柱內還原，可以直接獲得抗腫瘤19肽。蛋白的表達量高達58.51mg/L，復性后的重組蛋白對腫瘤細胞的抑制率為75%。
[0029]實施例3
[0030]將人工合成腫瘤抑素中185 — 203位氨基酸(19肽)所對應的核苷酸序列，連接至融合蛋白表達載體pet32a上；經過進一步酶切和測序鑒定后，轉化到BL21 (DE3)plysS大腸桿菌中進行誘導表達得到融合蛋白；誘導劑為IPTG，培養基的pH為6.0，接種量為2.1 %，誘導劑的濃度0.09mmol/L,誘導劑添加時間0D_為0.5，誘導溫度為45°C，誘導時間5h，表達的融合蛋白經幾丁質親和層析、二硫蘇糖醇(DTT)的柱內還原，可以直接獲得抗腫瘤19肽。蛋白的表達量高達56.32mg/L，復性后的重組蛋白對腫瘤細胞的抑制率為65%。
[0031]實施例4
[0032]將人工合成腫瘤抑素中185 - 203位氨基酸(19肽)所對應的核苷酸序列，連接至融合蛋白表達載體pet32a上；經過進一步酶切和測序鑒定后，轉化到Rosetta (DE3)大腸桿菌中進行誘導表達得到融合蛋白；誘導劑為乳糖，培養基的PH為7.0，接種量為1.5%，誘導劑的濃度0.08mmol/L,誘導劑添加時間0D_為0.6，誘導溫度為50°C，誘導時間4h，表達的融合蛋白經幾丁質親和層析、二硫蘇糖醇(DTT)的柱內還原，可以直接獲得抗腫瘤19肽。蛋白的表達量高達53.85mg/L，復性后的重組蛋白對腫瘤細胞的抑制率為68%。
【主權項】
1.一種運用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽的方法，其特征在于，包括以下幾個步驟: 1)將人工合成腫瘤抑素中185- 203位氨基酸(19肽)所對應的核苷酸序列，連接至融合蛋白表達載體上； 2)經過進一步酶切和測序鑒定后，轉化到大腸桿菌中進行誘導表達得到融合蛋白； 3)表達的融合蛋白經幾丁質親和層析、二硫蘇糖醇(DTT)的柱內還原，可以直接獲得抗腫瘤19肽。
2.根據權利要求1所述的一種運用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽的方法，其特征在于:所述步驟I中表達載體為pet32a。
3.根據權利要求1所述的一種運用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽的方法，其特征在于:所述步驟2中大腸桿菌種類為BL21 (DE3)plysS、BL21 (DE3)、BL21和Rosetta (DE3)中的至少一種，所述誘導表達的誘導劑為乳糖和IPTG中的至少一種，培養基的pH為5 — 9，接種量為I 一 10%，誘導劑的濃度0.05 - 0.5mmol/L，誘導劑添加時間OD6tltl為0.5 — 1.0，誘導溫度為20 - 70°C，誘導時間2 — 10h。
【專利摘要】本發明涉及一種運用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽的方法，將人工合成腫瘤抑素中185－203位氨基酸(19肽)所對應的核苷酸序列連接至融合蛋白表達載體上；經過進一步酶切和測序鑒定后，轉化到大腸桿菌中進行誘導表達得到融合蛋白；表達的融合蛋白經幾丁質親和層析、二硫蘇糖醇(DTT)的柱內還原，可以直接獲得抗腫瘤19肽。本發明提供的一種運用大腸桿菌作為生物反應器生產重組的抗腫瘤19肽的方法，生產重組的抗腫瘤19肽產量大，效率高，成本低，生產過程穩定。
【IPC分類】C07K7-08, C12R1-19, C12N15-70
【公開號】CN104593402
【申請號】CN201510030041
【發明人】孫旸, 陳 光, 孫春玉, 遲惠, 王剛, 陳歡, 王聰, 孫寧寧, 張斯童
【申請人】吉林農業大學
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月21日