一種鐵皮石斛內生真菌菌株nt12j04及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鐵皮石斛內生真菌菌株及其應用，屬于微生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 植物內生真菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各 種組織和器官內部的真菌，與菌根真菌只存在于植物根系不同，內生真菌在植株的地下和 地上部分的任何組織器官都能存在（Faeth&Fagan，2002)。研宄發現：植物內生真菌不僅包 括了互惠共利的和中性的內共生真菌，也包括了那些潛伏在宿主體內的病原菌；有的內生 真菌能促進宿主植物的生長、增強宿主的抗逆性、促進宿主植物活性成分的合成和積累，在 提高植物產量和質量中可以起到積極作用。因此，內生真菌與植物的互作研宄己日益受到 研宄者的關注，并成為內生真菌研宄領域的國際熱點。
[0003] 鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)屬蘭科附生草本植物，是我 國傳統名貴中藥，廣泛運用于慢性咽炎、閉塞性周圍血管病、白內障、青光眼等疾病的治療 藥方及各種保健品中，市場需求量很大，長期無節制的采挖造成其資源枯竭，已無野生資源 可用。近年來，鐵皮石斛的人工種植已在浙江、云南等地大規模開展，成為一個新興產業。因 此，研宄篩選具有明顯促生作用的鐵皮石斛內生真菌菌株，將對鐵皮石斛的大規模人工種 植具有重要意義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種具有明顯促生作用的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04 及其在鐵皮石斛生長中的應用。
[0005] 本發明所提供的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04,在分類學上屬于叢赤殼屬 (他(^1^&)，命名為他(^1^ &8口.，已于2014年7月9日保藏于中國典型培養物保藏中心，保 藏號為CCTCCN0.M2014332 ;該菌株的基因組18srDNA堿基序列如SEQIDNo. 1所示。
[0006] 本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04是采用內生真菌分離純化技術從 鐵皮石斛?endrobiumofficinaleKimuraetMigo)植物活體中分離、純化得到。
[0007] 本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04可通過制備成真菌誘導子培養基 或生物菌肥應用于鐵皮石斛的生長中。
[0008]由本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04制備真菌誘導子培養基的方法， 包括如下步驟：菌種活化一種子液培養一發酵培養一將發酵液真空抽濾，將菌絲體與液氮 研磨液與濾液合并后滅菌，得到真菌誘導子一將真菌誘導子接入MS培養基中，即得真菌誘 導子培養基。
[0009] 作為優選方案，真菌誘導子按5%?15%體積的量接入MS培養基中。
[0010] 由本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04制備生物菌肥的方法，包括如下 步驟：菌種活化一種子液培養一發酵培養一將發酵液與樹皮粉攪拌混勻，即得生物菌肥。
[0011] 作為優選方案，按每50g樹皮粉加5?15mL發酵液攪拌混勾。
[0012] 作為優選方案，上述的菌種活化采用試管斜面培養，培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培養基（固體PDA)，于28 ± 1°C活化培養72小時。
[0013] 作為優選方案，上述的種子液培養采用馬鈴薯葡萄糖液體培養基（液體PDA)，于 28±1°C搖床培養72小時。
[0014] 作為優選方案，上述的發酵培養采用馬鈴薯葡萄糖液體培養基（液體PDA)，于 28±1°C發酵培養7天，接種量為5V%?15V%。
[0015] 實驗證明：采用本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04制備的真菌誘導子 培養基和生物菌肥均對鐵皮石斛的生長具有明顯的促進作用，可用于鐵皮石斛的人工種植 中，以提高鐵皮石斛的產量，具有顯著的應用價值。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04在100倍顯微鏡下觀察到的 菌絲形態圖。
[0017]圖2為本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04在電子顯微鏡下觀察到的菌 絲形態圖。
[0018]圖3為本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04在電子顯微鏡下觀察到的孢 子形態圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限 定的范圍。
[0020] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件、實驗室手冊中所 述的條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0021] 實施例1
[0022] 本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04于2014年7月9日保藏于中國典 型培養物保藏中心（湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學，郵編430072)，保藏號為CCTCC N0.M2014332;該菌株的基因組18srDNA堿基序列如SEQIDNo. 1所示。
[0023] 所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04的固體培養特征為：
[0024] 在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA)培養基上于28±1°C培養，最初氣生菌絲無色，漸變灰 白色；菌落呈灰白色絨毛狀，邊緣不整齊；菌絲體灰白色，發達，背面黃綠色。
[0025] 所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04的液體培養特征為：
[0026]a)培養基PDA，搖瓶培養7天，培養溫度為28±1°C;
[0027]b)發酵培養特征：培養第1-2天，未見明顯生長現象；培養第3天，有白色菌絲出 現；培養第4-5天，菌絲增多；培養第6天，形成直徑l-2mm白色菌絲球；培養第7天，菌絲 球增大到2_4mm。
[0028] 本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04的形態特征為：
[0029] 1、無性世代，菌絲體密集，成樹枝狀，側生大量帶梗孢子囊，孢子囊中最多可含8 個孢子。
[0030] 2、有性世代，未發現。
[0031] 實施例2
[0032] 1)取本發明的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04菌種，在無菌條件下，用接種針挑 取少量菌絲，接入已滅菌的固體PDA培養基試管，于28±1°C活化培養72小時；
[0033] 2)取活化培養后的菌種，在無菌條件下，轉接入已滅菌的液體PDA種子培養基中， 于28± 1°C、140rpm搖床培養72小時，得種子液；
[0034] 3)在無菌條件下，按10V% (體積百分比）接種量接入500mL液體PDA培養基中， 于28 ± 1°C、140rpm搖床培養7天；
[0035] 4)將發酵液真空抽濾，將菌絲體與液氮的研磨液與濾液合并后于121°C滅菌20分 鐘，得到真菌誘導子；
[0036] 5)將真菌誘導子按10%體積的量接入MS培養基中，得到真菌誘導子培養基；
[0037] 6)在無菌條件下，接苗于對照（MS)培養基和真菌誘導子培養基中，無菌室培養， 記錄好苗的數量，根數目及高度；
[0038] 7)定期觀察，培養6個月后，對原球莖、苗進行稱重，并計算增苗棵數，與對照組進 行組間分析；觀察結果見表1所示；
[0039] 表1真菌誘導子對鐵皮石斛苗增殖分化的影響（X土S) 「00401
【主權項】
1. 一種鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04,其特征在于：該菌株在分類學上屬于叢赤殼 屬，命名為Nectria sp.，已于2014年7月9日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為 CCTCC N0.M2014332 ;該菌株的基因組18s rDNA堿基序列如SEQ ID No. 1所示。
2.權利要求1所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT 12J04在鐵皮石斛生長中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于：將鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04制備成 真菌誘導子培養基或生物菌肥應用于鐵皮石斛的生長中。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，由所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04制 備真菌誘導子培養基的方法包括如下步驟：菌種活化一種子液培養一發酵培養一將發酵液 真空抽濾，將菌絲體與液氮研磨液與濾液合并后滅菌，得到真菌誘導子一將真菌誘導子接 入MS培養基中，即得真菌誘導子培養基。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于：真菌誘導子按5%?15%體積的量接入MS 培養基中。
6.如權利要求3所述的應用，其特征在于，由所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04制 備生物菌肥的方法包括如下步驟：菌種活化一種子液培養一發酵培養一將發酵液與樹皮粉 攪拌混勻，即得生物菌肥。
7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于：按每50g樹皮粉加5?15mL發酵液攪拌混 勻。
8.如權利要求4或6所述的應用，其特征在于：所述的菌種活化采用試管斜面培養，培 養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，于28±1°C活化培養72小時。
9.如權利要求4或6所述的應用，其特征在于：所述的種子液培養采用馬鈴薯葡萄糖 液體培養基，于28±1 °C搖床培養72小時。
10.如權利要求4或6所述的應用，其特征在于：所述的發酵培養采用馬鈴薯葡萄糖液 體培養基，于28± 1°C發酵培養7天，接種量為5V%?15V%。
【專利摘要】本發明公開了一種鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04及其應用，所述菌株NT12J04在分類學上屬于叢赤殼屬，命名為Nectria sp.，已于2014年7月9日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO.M2014332；該菌株的基因組18s rDNA堿基序列如SEQ ID No.1所示。實驗證明：采用本發明所述的鐵皮石斛內生真菌菌株NT12J04制備的真菌誘導子培養基和生物菌肥均對鐵皮石斛的生長具有明顯的促進作用，可用于鐵皮石斛的人工種植中，以提高鐵皮石斛的產量，具有顯著的應用價值。CCTCC NO.M201433220140709
【IPC分類】C05F11-08, C12N1-14, C12R1-645
【公開號】CN104593272
【申請號】CN201510043890
【發明人】黎萬奎, 王莉莉, 馬昭, 唐承晨, 張純, 胡之璧, 王崢濤
【申請人】上海中醫藥大學
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月28日