Her2基因擴增檢測探針、試劑盒以及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及HER2基因擴增 檢測探針、試劑盒以及方法。
【背景技術】
[0002] 人類HER-2/neu基因（Her-2基因）基因定位于染色體17q21，其編碼產物為185kD 的跨膜精蛋白P185,由1255個氨基酸組成，720- 987位屬于酪氨酸激酶區，其結構示意圖 如圖1所示。Her-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜慵蛋白，是EGFR家族成員之 一。Her-2/neu蛋白由胞外的配體結合區、單鏈跨膜區及胞內的蛋白酪氨酸激酶區三部分 組成，由于目前尚未發現能與Her-2/neu蛋白直接結合的配體.其主要通過與家族中其他 成員包括EGFR(HERVerbBI)，HER3/erbB3。HER4/erbB4形成異二聚體而與各自的配體結 合。Her-2/neu蛋白常為異二聚體首選伴侶，且活性常強于其它異二聚體。當與配體結合 后，主要通過引起受體二聚化及胞漿內酪氨酸激酶區的自身磷酸化.激活酪氨酸激酶的活 性。Her-2/neu蛋白在胃癌中的表達情況及影響因素 Her-2/neu蛋白通常只在胎兒時期表 達，成年以后只在極少數組織內低水平表達。然而在多種人類腫瘤中卻過度表達，如乳腺 癌、卵巢癌、肺腺癌、原發性。腎細胞癌、子宮內膜癌等，并提示預后不良。熒光原位雜交的 方法檢測乳腺癌細胞中Her-2/neu基因（17ql2)的擴增，作為判斷預后以及乳腺癌藥物治 療，尤其是抗HER-2單克隆抗體（赫賽汀）靶向治療的一項輔助檢測手段。
[0003] 目前檢測HER2基因的方法包括：免疫組織化學（IHC)法檢測HER2蛋白過表達、熒 光原位雜交（FISH)法檢測HER2基因拷貝數、酶聯免疫吸附試驗（ELISA)檢測血清HER2E⑶ 或腫瘤組織P185。但病理常規工作中最實用的方法是IHC和FISH。IHC較FISH節約成本、 簡單易行，但容易受到組織處理方法、固定時間等影響，其結果判斷和解釋存在較大的變 異，而FISH具有高度的重復性和可靠性。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的之一是HER2基因擴增檢測試劑盒，該檢測試劑盒可用于高特異性 和高準確性檢測HER2基因擴增的情況。
[0005] 實現上述目的的技術方案如下。
[0006] HER2基因擴增檢測試劑盒，包括有標記熒光染料的、針對HER2基因的第一組探針 和針對人類17號染色體著絲粒區域的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41- SEQ ID NO. 50中的至少一條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中 的至少一條探針；上述兩組探針所標記的熒光染料顏色不一樣。
[0007] 在其中一個實施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
[0008] 在其中一個實施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少八條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少八條探針。
[0009] 在其中一個實施例中，所述第一組探針為SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50,所述第 二組探針為 SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60。
[0010] 在其中一個實施例中，所述SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50依次分別由以下引物擴 增制備得到：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20。
[0011] 在其中一個實施例中，所述SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60依次分別由以下引物擴 增制備得到：SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、 SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40。
[0012] 本發明的另一目的是提供一種HER2基因擴增檢測探針。
[0013] 實現上述目的技術方案如下：
[0014] HER2基因擴增檢測探針，針對HER2基因的第一組探針和針對人類17號染色體著 絲粒區域的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少一 條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一條探針。
[0015] 在其中一個實施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
[0016] 本發明的另一目的是提供一種HER2基因擴增檢測方法。
[0017] 實現上述目的的技術方案如下。
[0018] -種HER2基因擴增檢測方法，包括
[0019] 待檢測樣品切片預處理；
[0020] 利用上述HER2基因擴增檢測試劑盒進行雜交檢測；
[0021] 復染后在顯微鏡下觀察焚光信號。
[0022] 本發明的主要優點在于：
[0023] 1.本發明所提供的HER2基因擴增檢測試劑盒的檢測結果與Cytocell公司產品 HER2檢測產品的吻合率高達100%。
[0024] 2.本發明制備的檢測HER2基因擴增的FISH探針，不含有重復序列，能夠避免交叉 反應，與染色體中HER2目標檢測片段進行識別雜交，具有準確性高，特異性好、及假陽性低 的優點。
[0025] 3.本發明所述試劑盒的操作簡單、安全，同時減少了 Cot-IDNA試劑、羅丹明抗-地 高辛抗體等昂貴試劑的使用，經濟高效；
[0026] 4.與現有技術相比，本發明所述試劑盒的檢測方法，無需使用Cot-IDNA對樣本基 因進行封閉，操作方便，檢測速度快，可在12-24小試內完成雜交檢測實驗。
【附圖說明】
[0027] 圖1為信號選擇與計數指南示意圖，其中，黑色點表示紅色信號點；白色點表示綠 色信號點。
【具體實施方式】
[0028] 為了更好地理解本發明，下面結合附圖、實施例進一步闡明本發明的內容，但本發 明的保護范圍不局限于下面的實施例。
[0029] 實施例1
[0030] 本實施例所述的檢測HER2基因擴增檢測探針和試劑盒，其設計如下：
[0031] 一、設計擴增引物
[0032] 分別針對HER2基因和人類17號染色體著絲粒區域設計兩組擴增引物，其中第一 組為針對HER2的擴增引物，第二組為針對人類17號染色體著絲粒區域的擴增引物，相應的 擴增產物分別組成了第一組探針庫和第二組探針庫。每組擴增引物得到的擴增產物能作為 重排的FISH探針，不含有重復序列，能夠避免交叉反應，與染色體中HER2目標檢測片段進 行特異性識別雜交。
[0033] 人工合成如下引物，擴增引物及其相應的擴增產物具體見表1(注：1F/1R為一 對引物，分別表示正向引物和反向引物；其他以此類推）。合成后的每條擴增引物分別用 10mmol/L Tris Buffer 配制成 100pmol/mL 的存液。
[0034] 表1擴增引物及擴增產物
[0035]
【主權項】
1. HER2基因擴增檢測試劑盒，其特征在于，包括有標記熒光染料的、針對HER2基因的 第一組探針和針對人類17號染色體著絲粒區域的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少一條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少一條探針；所述第一組探針與第二組探針所標記的熒光染料顏色不一 樣。
2. 根據權利要求1所述的HER2基因擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述第一組探針 為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
3. 根據權利要求2所述的HER2基因擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述第一組探針 為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少八條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少八條探針。
4. 根據權利要求3所述的HER2基因擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述第一組探針為 SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50,所述第二組探針為 SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60。
5. 根據權利要求1-4任一項所述的HER2基因擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50依次分別由以下引物擴增制備得到：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20。
6. 根據權利要求1-4任一項所述的HER2基因擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60依次分別由以下引物擴增制備得到：SEQ ID NO. 21和SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、 SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40。 7. HER2基因擴增檢測探針，其特征在于，針對HER2基因的第一組探針和針對人類17號 染色體著絲粒區域，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少一條探 針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一條探針。
8. 根據權利要求7所述的HER2基因擴增檢測探針，其特征在于，所述第一組探針為 選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
9. 一種HER2基因擴增檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 待檢測樣品切片預處理； 利用權利要求1一6任一項所述HER2基因擴增檢測試劑盒進行雜交檢測； 復染后在顯微鏡下觀察焚光信號。
【專利摘要】本發明公開了HER2基因擴增檢測探針、試劑盒以及方法，包括有標記熒光染料的、針對HER2基因的第一組探針和針對人類17號染色體著絲粒區域的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少一條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少一條探針；上述兩組探針所標記的熒光染料顏色不一樣。本發明所提供的HER2基因擴增檢測試劑盒中的FISH探針，不含有重復序列，能夠避免交叉反應，與染色體中HER2目標檢測片段進行識別雜交，具有準確性高，特異性好、及假陽性低的優點。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104561361
【申請號】CN201510053892
【發明人】胡文暉, 吳詩揚, 廖傳榮, 黃萌
【申請人】益善生物技術股份有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月30日