雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調控基因的鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物基因工程技術領域，尤其涉及一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調 控基因的鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis)為革蘭氏陰性菌，是一種危害較大的食 源性致病菌，感染家禽后，為家禽生產和人類健康帶來嚴重的經濟損失和安全隱患。
[0003] DNA的甲基化是真核生物主要的表觀遺傳修飾，是表觀遺傳學的重要組成部分，在 維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤及相關疾病發生中起著重要作用，異 常甲基化的發生是導致疾病的一大關鍵因素。啟動子區域CpG島（CGI)高甲基化導致免疫 基因表達失活是目前疾病研宄中的熱點課題。
[0004] 目前，有人比較了不同雞種生長快慢之間的甲基化差異，或利用MEDIP技術分析 了在感染致病型大腸桿菌后雞脾臟全基因組甲基化變化和表達的關系，微生物在感染哺乳 動物后能夠通過引起基因的高甲基化而引發各種疾病，而關于腸炎沙門氏菌感染對雞全基 因組甲基化水平影響的報道較少，且尚無關于鑒定在腸炎沙門氏菌感染中發揮甲基化調控 基因的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的實施例提供一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調控基因的鑒定方法，可以 鑒定在雞腸炎沙門氏菌感染中發揮甲基化調控作用的基因。
[0006] 為達到上述目的，本發明的實施例采用如下技術方案：
[0007] 一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調控基因的鑒定方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0008] S1、選擇2日齡沙門氏菌陰性雞，均分為試驗組和對照組；所述試驗組通過口腔灌 服法接種0. 3ml腸炎沙門氏菌，接種量為2-4X IO8Cfu/只，所述對照組接種0. 3mL的磷酸 鹽緩沖溶液；
[0009] S2、接種14天后，根據感染腸炎沙門氏菌的盲腸內容物細菌含量結果，選擇實驗 組中細菌含量最多的個體3-6個；隨機選擇對照組中等數量的個體；被選中的每只雞的脾 臟作為一個樣本；
[0010] S3、從各個樣本中提取DNA，實驗組和對照組各構建2個DNA混池，利用DNA的破碎 試劑盒將各個DNA混池中的DNA打斷至150-800bp的大小不等DNA片段，用T4DNA聚合酶 和Klenow酶將得到的所有DNA片段修飾成平末端；
[0011] S4、用Agencourt公司的產品AMPure XP磁珠篩選300_400bp的修飾成平末端的 DNA片段并純化；
[0012] S5、在篩選出的DNA片段的平末端序列末端加腺嘌呤變成粘性末端；
[0013] S6、將篩選出的DNA片段與接頭序列連接，采用甲基化DNA沉淀試劑盒對連接完成 后的序列樣品進行甲基化的DNA富集，驗證擴增純化后進行測序以確定甲基化發生差異的 具體基因；
[0014] S7、進行數據分析，獲得MeDIP-Seq數據產出統計表，如表1所示，從整體水平表示 了從樣品中收集到全基因組參與測序的獨有數據情況，且數據比對到基因組的比例較高， 說明數據質量來源可靠，可以進一步分析；圖1表示的是每條染色體上DMR所占的百分比， 橫坐標表示每條染色體（chr)，縱坐標指甲基化差異區域占每條染色體總長的比例，此圖能 總體簡略看出甲基化在整個基因組中所占的比例，除16、21和25號染色體外，DMR在各染 色體均有分布，比例較高的是10、11和24號染色體；在表2里，展示了 DMR在各個區域的分 布情況，通過表2,我們了解到甲基化是發生在包括內含子在內的整個基因組，并非只在轉 錄基因體現，說明甲基化在表觀遺傳現象起到的作用是通過多個基因位置實現的，如DNA， RNA ;圖2表示的是甲基化差異顯著基因的基因本體論功能分析，在這個表中，我們對差異 基因的功能進行聚類分析，全面了解甲基化差異的基因在感染中發揮的作用，篩選出在多 個功能類別中存在頻率較高的基因，用于進一步鑒定感染中發揮重要作用的基因；表3是 對差異基因的信號通路分析，信號通路是指響應某一信息源而執行一定功能的通路，基因 在信號通路中發揮各自的作用，參與生物功能代謝等，也作為鑒定基因功能的因素之一；表 4是顯著差異基因甲基化的倍數變化，表中直觀展示了差異上調和下調倍數較大的前22個 基因，是篩選基因的主要依據；表5是將所有的差異基因進行本體論分析后，將其所包含的 全部基因重復數進行統計后得到的結果，對功能的分析和基因的鑒定有重要的參考價值。
[0015] S8、通過對甲基化差異基因的鑒定和對基因的功能和信號通路分析，結合差異基 因的甲基化倍數變化，鑒定得出腸炎沙門氏菌感染中發揮甲基化調控的基因。
[0016] 上述技術方案提供的方法中，脾臟是重要的免疫器官，利用雞脾臟組織樣品為試 驗材料，利用上述測序鑒定在雞腸炎沙門氏菌感染中的甲基化差異基因，將會為我們進一 步探討甲基化在腸炎沙門氏菌感染中的調控作用以及篩選雞抗沙門氏菌感染的分子標記 奠定基礎。
【附圖說明】
[0017] 圖1為各染色體上DMR占每條染色體的百分比圖示；
[0018] 圖2為甲基化差異顯著基因的基因本體論功能分析圖示。
【具體實施方式】
[0019] 下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于 本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0020] 本發明的實施例提供一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調控基因的鑒定方法，如圖 1所示，所述方法包括以下步驟：
[0021] S1、選擇2日齡沙門氏菌陰性壽光雞，均分為試驗組和對照組；所述試驗組通過口 腔灌服法接種0. 3mL腸炎沙門氏菌菌液2-4 X IOScfu/只，菌液稀釋液為磷酸鹽緩沖溶液， 所述對照組接種0. 3mL的磷酸鹽緩沖溶液，對照組的設立，使試驗結果的差異僅為腸炎沙 門氏菌感染的影響，較好的平衡和抵消了無關變量的影響，使試驗結果更具有說服力。
[0022] 首先，選擇1日齡山東壽光雞，利用平板試驗法檢測并篩選沙門氏菌陰性個體，獲 得2日齡沙門氏菌陰性壽光雞。
[0023] S2、接種后14天后，根據感染腸炎沙門氏菌的盲腸內容物細菌含量結果，選擇實 驗組中細菌含量最多的3-6只壽光雞；任意選擇對照組中等數量的壽光雞；被選中的每個 壽光雞的脾臟作為一個樣本。
[0024] 根據感染腸炎沙門氏菌的盲腸內容物細菌含量結果，選擇接種后14日齡脾臟樣 品做全基因組甲基化測序（MEDIP-seq)，對照組3-6個樣本，實驗組3-6個樣本。
[0025] S3、從各個樣本中提取DNA，實驗組和對照組各構建1個DNA混池，利用DNA的破碎 試劑盒（Bioo Scientific Corporation)將各個DNA混池中的DNA打斷至150_800bp的大 小不等片段，用T4DNA聚合酶和克列諾酶將得到的所有片段修飾成平末端。
[0026] S4、用Agencourt公司的產品AMPure XP磁珠篩選300_400bp大小的修飾成平末 端的DNA片段并純化。
[0027] S5、在篩選出的DNA片段的平末端的序列末端加腺嘌呤變成粘性末端。
[0028] 在平末端的序列末端加腺嘌呤變成粘性末端，可以減少在連接接頭序列時各DNA 片段之間的互連，保證接頭序列與DNA片段片段之間的特異性連接。
[0029] S6、將篩選出的DNA片段與接頭序列連接，采用甲基化DNA沉淀試劑盒（Zymo Research Corp.，Cat.#D5101)對連接完成后的序列樣品進行甲基化的DNA富集，驗證擴增 純化后進行測序以確定甲基化發生差異的具體基因。
[0030] S7、進行數據分析，獲得MeDIP-Seq總數據產出統計表，根據DMR位置和長度計算 各染色體上DMR占每條染色體的百分比，總結DMR在各個區域的分布情況；進行甲基化差異 基因的鑒定，獲得基因 CGI的DMRs分類餅圖以及基因角度的DMRs分類餅圖，對甲基化差異 基因進行基因本體論分析，差異基因的信號通路分析，顯著差異基因甲基化的倍數變化。
[0031] MEDIP是甲基化DNA免疫共沉淀的簡稱，MEDIP-seq是通過抗5-甲基胞嘧啶（5mC) 的抗體分離出甲基化的DNA片段，通過高通量測序在全基因組水平上進行高甲基化區域的 研宄，被用于富集甲基化的DNA的序列，甲基化在生物學過程中發揮著重要的作用。DMR是 甲基化差異區域，是指不同樣本中的不同的甲基化狀態的基因組區域。
[0032] 其中，MeDIP-Seq數據產出統計表如表1所示：
[0033] 表I MeDIP-Seq總數據產出統計
[0034]
【主權項】
1. 一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調控基因的鑒定方法，其特征在于，包括以下步 驟： 51、 選擇沙門氏菌陰性壽光雞，均分為試驗組和對照組；所述試驗組通過口腔灌服法接 種0. 3ml腸炎沙門氏菌，2-4 X IO8Cfu/只，所述對照組接種0. 3mL的磷酸鹽緩沖溶液； 52、 接種14天后，根據感染腸炎沙門氏菌雞只盲腸內容物細菌含量結果，選擇實驗組 中細菌含量最多的個體3-6個；任意選擇對照組中等數量的個體；被選中的每個個體的脾 臟作為一個樣本； 53、 從各個樣本中提取DNA，實驗組和對照組各構建1個DNA混池，利用The AIRtmDNA破 碎試劑盒將各DNA混池中的DNA打斷至150-800bp的大小不等DNA片段，用T4DNA聚合酶 和克列諾酶將得到的所有DNA片段修飾成平末端； 54、 用Agencourt公司的產品AMPure XP磁珠篩選300_400bp的修飾成平末端的DNA 片段并純化； 55、 在篩選出的DNA片段的平末端序列末端加腺嘌呤變成粘性末端； 56、 將篩選出的DNA片段與接頭序列連接，采用甲基化DNA沉淀試劑盒對連接完成后的 序列樣品進行甲基化DNA富集，驗證擴增純化后進行測序以確定甲基化發生差異的具體基 因； 57、 進行數據分析，獲得MeDIP-Seq數據產出統計表，各染色體上DMR所占百分比，DMR 在各個區域的分布情況，甲基化差異顯著基因的基因本體論功能分析，差異基因的信號通 路分析，顯著差異基因甲基化的倍數變化； 58、 通過對甲基化差異基因的鑒定和對基因的功能和信號通路分析，結合差異基因的 甲基化倍數變化，鑒定得出腸炎沙門氏菌感染中發揮甲基化調控的基因。
【專利摘要】本發明提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染甲基化調控基因的鑒定方法，涉及生物基因工程技術領域，可以鑒定在雞腸炎沙門氏菌感染中發揮甲基化調控作用的基因。所述方法包括利用雞脾臟組織樣品為試驗材料，對其進行處理后，進行甲基化DNA富集，驗證擴增純化后進行測序；通過對基因甲基化差異的鑒定和對基因功能和信號通路的分析，結合基因甲基化差異倍數變化，鑒定得出腸炎沙門氏菌感染中發揮甲基化調控的基因。
【IPC分類】C12R1-42, C12Q1-68
【公開號】CN104561330
【申請號】CN201510027797
【發明人】李顯耀, 王莎莎, 劉麗英, 吳桂賢
【申請人】山東農業大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月17日