提高大腸桿菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種添加 Fe2+提高大腸桿菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，屬于 代謝工程和微生物發酵領域。
【背景技術】
[0002] 5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid, ALA)，分子式為 C5O3NH9，分子量為 131. 13,恪點為149-151°C，它是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素 B12等關鍵前體物質。 ALA作為一種安全、選擇、滲透性好的光動力學藥物在醫學領域逐漸受到重視，已成功應用 于皮膚癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的診斷和光動力治療中。另外，由于ALA在自然界中可 降解，在農藥領域應用也非常廣泛，如作為一種無公害的新型光活化農藥、除草劑以及植物 生長調節劑等。
[0003] 目前，ALA主要合成方法是化學法合成，最早出現在上世紀50年代，到20世紀90 年代，相關研宄開始大量開展，并取得一定的成績。但是由于化學合成反應步驟繁瑣，副產 物多，分離提純困難，ALA的得率也較低，并且環境污染嚴重等問題，近年來，微生物發酵生 產ALA已成為研宄的熱點。自然界中，ALA的生物合成存在兩條途徑，一條是C4途徑，由 5-氨基乙酰丙酸合成酶（ALAS，hemA編碼）催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促 反應組成，主要存在于一些光合細菌、真菌以及動物體內。另外一條是C5途徑，首先谷氨酸 在谷氨酰-tRNA合成酶（GluRS，gltX編碼）催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA 在谷氨酰-tRNA還原酶（GluTR，hemA編碼）作用下生成谷氨酸-1-半酸（GSA)，最后GSA由 谷氨酸-1-半醛-2, 1-氨基轉移酶（GSA-AT，hemL編碼）催化生成ALA。該途徑廣泛存在 于植物、藻類以及細菌（如大腸桿菌）中。
[0004] 早期，人們篩選到產ALA的光合細菌類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides)，通 過誘變育種法對其進行誘變，篩選ALA的高產菌株，并通過發酵優化等使得ALA的產量達到 7. 2g/L。但由于光合細菌的特殊性，其成本較高，不適合大規模的工業化生產。隨著基因工 程技術的成熟，Mariet和Zeikus選用大腸桿菌作為宿主細胞，采用基因工程的技術表達來 源于R.sphaeroides的ALA合酶基因（hemA)，ALA產量為3.79g/L。Xie et al.等利用過 量表達R. sphaeroides來源的hemA基因，經發酵優化，ALA產量最高達到5. 2g/L。但目前 以C4途徑為基礎的生物轉化由于添加前體琥珀酸和甘氨酸生產ALA成本相對較高，Kang et al.等通過分析大腸桿菌中C5途徑的調控機制，發現ALA合成C5途徑的關鍵基因 hemA 和hemL，同時實現了以葡萄糖為唯一碳源發酵生產ALA。
[0005] 本發明在表達5-氨基乙酰丙酸C5合成途徑關鍵酶基因 hemL和hemA和表達來源 于大腸桿菌血紅素生物合成途徑基因 hemD及hemF的基礎上，通過添加 Fe2+及優化添加量， 實現了 ALA產量的進一步提高。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種提高大腸桿菌工程菌株產5-氨基乙酰丙酸 的方法，是控制初始發酵培養基中Fe 2+濃度為0. 0036-0. 036mM〇l/L，實現ALA產量的進一 步提尚。
[0007] 所述大腸桿菌工程菌株是以大腸桿菌為宿主，使用不同拷貝數的表達載體過量表 達谷氨酰-tRNA還原酶（hemA編碼）、谷氨醛氨基轉移酶（hemL編碼）、尿卟啉原III合酶 (hemD編碼）和糞卟啉原III氧化酶（hemF編碼）。
[0008] 在本發明的一種實施方式中，所述大腸桿菌是E. coli BL21(DE3)。
[0009] 在本發明的一種實施方式中，所述不同拷貝數表達載體分別為pRSFDuet-1和 pETDuet-Ι〇
[0010] 在本發明的一種實施方式中，所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 在本發明的一種實施方式中，所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 在本發明的一種實施方式中，所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0013] 在本發明的一種實施方式中，所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，以pRSFDuet-1表達hemA、hemL、hemF，以pETDuet-1 表達hemD，將兩個質粒轉入大腸桿菌得到大腸桿菌工程菌株。
[0015] 所述大腸桿菌工程菌株是 E. coli BL21 (DE3)/pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF+pETD uet-l-hemD〇
[0016] 所述方法是在發酵起始階段向本身不含亞鐵離子的發酵培養基中添加 I. O-IOmg/ L FeSO4 · 7H20〇
[0017] 在本發明的一種實施方式中，初始發酵培養基中含10mg/L FeSO4 · 7H20。
[0018] 在本發明的一種實施方式中，將重組菌活化后以2-5%接種量轉接發酵培養基 中發酵，Oh時添加0. 1-0. 5mM IPTG誘導基因表達，添加1.0-10mg/L FeSO4，氨芐青霉素 和卡那霉素，30-37°C，200r/min 培養，周期 28-36h。發酵培養基（g/L) :(NH4)2S0410-15， ΚΗ2Ρ044· 5-5. 0, Na2HPO4 · 12H20 12-15, MgSO4 · 7H20 0· 8-1. 0,酵母提取物 0· 8-1. 0,葡萄糖 15-20, pH 7. 0〇
[0019] 本發明以表達C5途徑關鍵基因 hemL和hemA以及ALA代謝途徑的下游基因 hemD 和hemF的重組菌為生產菌株，通過添加 Fe2+，提高了 ALA的產量。在此基礎上，通過優化Fe2+ 的添加量及在3L發酵罐中方法培養，所得大腸桿菌工程菌株在3L發酵罐能夠積累5-氨基 乙酰丙酸3850mg/L，有效地利用C5途徑促進5-氨基乙酰丙酸的合成，實現了 ALA產量的進 一步提尚。
【附圖說明】
[0020] 圖I :Fe2+對細胞生長及產物ALA合成的影響
[0021] LADF_6:E. coli BL21(DE3)/pRSFDuet-l-hemA-hemL-hemFpETDuet-l-hemD〇
[0022] A :0D600nm，B :ALA 產量。
[0023] 實心圖標為添加 Fe2+，空心圖標為不添加 Fe2+。
[0024] 圖2 :不同濃度的Fe2+對重組大腸桿菌積累ALA的影響
[0025] LADF_6:E. coli BL21(DE3)/pRSFDuet-l-hemA-hemL-hemFpETDuet-l-hemD〇
[0026] 圖3 :重組大腸桿菌LADF-6發酵過程曲線圖
[0027] LADF_6:E. coli BL21(DE3)/pRSFDuet-l-hemA-hemL-hemFpETDuet-l-hemD〇
【具體實施方式】
[0028] ALA分析方法：
[0029] 采用Mauzerall和Granick的分光光度法：將樣品稀釋至2mL，加入ImL的乙酸鹽 緩沖液，〇. 5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷卻至室溫，取2mL的反應液至新管中，然后 加入2mL的Modified Ehrlich' s試劑，反應20min，利用分光光度計554nm下檢測。
[0030] 培養基：
[0031] 斜面培養基（g/L):蛋白胨10,氯化鈉10,酵母粉5. 0,瓊脂20, pH 7. 0 ;
[0032] 種子培養基（g/L):蛋白胨10,氯化鈉10,酵母粉5. 0, pH 7. 0,裝液量 20mL/250mL ；
[0033] 發酵培養基（g/L) : (NH4)2S0415, ΚΗ2Ρ045· 0, Na2HPO4 · 12H20 15, MgSO4 · 7H20 1. 0， 酵母提取物I. 〇,葡萄糖20, pH 7. 0。
[0034] 培養條件：
[0035] 菌種培養：甘油管劃線，然后挑取單菌落劃線平板37°C培養，作為種子來源；
[0036] 種子培養：平板挑取菌體，37°C，200r/min，根據要求添加氨芐青霉素 lOOyg/mL， 卡那霉素50 μ g/mL，培養約12h，轉接發酵培養基；
[0037] 發酵培養：以2%接種量轉接，Oh時添加 L 0-15mg/L的FeSO4 · 7Η20,0· 1-0. 5mM IPTG誘導基因表達，根據需要添加芐青霉素（lOOyg/mL)以及卡那霉素（SOyg/mL)， 30-37°C，200r/min 培養，周期 28-36h。
[0038] 實施例1添加 Fe2+對大腸桿菌工程菌株的影響
[0039] 菌株：LADF-6 : E. co I i BL21 (DE3) / pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF pETDuet-1-hemD。發酵Oh時添加2. 5mg/L的FeSO4 · 7H20,分析細胞的生長情況及目的產 物ALA的積累情況，結果如圖1所示，添加 Fe2+后，細胞量提高，產物ALA的合成也加快。
[0040] 實施例2優化Fe2+濃度提高ALA產量
[0041] 菌株：LADF_6:E. coli BL21 (DE3)pRSFDuet-l-hemLA-hemFpETDuet-l-hemD〇
[0042] 分析考察重組大腸桿菌在添加不同濃度的Fe2+時ALA的積累量，結果如圖2所示， 添加不同濃度Fe 2+時重組大腸桿菌積累ALA的量不同，隨著Fe 2+添加量的增加，ALA產量逐 漸提尚，但大于l〇mg/L時，ALA的積累量下降。
[0043] 實施例3重組菌3L發酵罐發酵驗證
[0044] 菌株：LADF_6:E. coli BL21 (DE3)pRSFDuet-l-hemLA-hemFpETDuet-l-hemD〇
[0045] 重組大腸桿菌LADF-6在3L發酵罐中發酵生產，接種量2%，初始葡萄糖濃度為 33g/L，Oh添加 I. 0-15mg/L的FeSO4,0. 1-0. 5mM IPTG誘導以及相應的抗生素，IOh后ALA開 始大量積累，在30h左右產量最高，為3. 85g/L (圖3)。
[0046] 雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種提高大腸桿菌工程菌株產5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，控制發酵培養 基中Fe 2+的初始濃度為0. 0036-0. 036mMol/L。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌工程菌株是以大腸桿菌為 宿主，使用不同拷貝數的表達載體過量表達谷氨酰-tRNA還原酶、谷氨醛氨基轉移酶、尿卟 啉原III合酶和糞卟啉原III氧化酶。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌是E. coli BL21 (DE3)。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述不同拷貝數表達載體分別為 pRSFDuet-1和 pETDuet-l〇
5. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，以pRSFDuet-1表達hemA、hemL、hemF，以 pETDuet-1表達hemD，將兩個質粒轉入大腸桿菌得到大腸桿菌工程菌株。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在發酵起始階段向本身不含亞鐵離子的 培養基中添加 I. 〇-l〇mg/L FeSO4 · 7H20。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，將重組菌活化后以2-5 %接種量轉接發酵 培養基中發酵，Oh時添加0. 1-0. 5mM IPTG誘導基因表達，添加 I. 0-10mg/L FeSO4 ·7Η20,氨 芐青霉素和卡那霉素，30-37°C，200r/min培養，周期28-36h。
8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，發酵培養基按g/L計含：(NH4)2S0410-15， ΚΗ2Ρ044· 5-5. 0, Na2HPO4 · 12H20 12-15, MgSO4 · 7H20 0· 8-1. 0,酵母提取物 0· 8-1. 0,葡萄糖 15-20, pH 7. 0〇
【專利摘要】本發明公開了一種添加Fe2+提高大腸桿菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，屬于代謝工程和微生物發酵領域。本發明以已構建的合成5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌Escherichia？coli？BL21(DE3)LADF-6為出發菌株，考察培養基中添加Fe2+對ALA合成的影響，通過發酵驗證，目的產物ALA產量有明顯提高，30h時ALA產量為2.25g/L。在此基礎上，經過優化Fe2+的初始添加量并在3L發酵罐中放大培養，當添加10mg/L的Fe2+時，ALA產量為3.85g/L。
【IPC分類】C12P13-00, C12R1-19
【公開號】CN104561158
【申請號】CN201510017646
【發明人】康振, 陳堅, 堵國成, 張俊麗
【申請人】江南大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月13日