小麥mlo型白粉病基因的快速鑒定的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明是利用植物比較基因組學、遺傳學、生物信息學和候選基因策略等方法快 速鑒定小麥白粉病基因，主要涉及到小麥MLO型基因序列的下載，候選基因的鑒定，基因的 比對，聚類等手段，進而鑒定出白粉病基因，屬于植物生物技術科學領域。
【背景技術】
[0002] 小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌（Blumeria graminif. sp. tritici，Bgt)引起 的，是影響世界小麥生產的主要病害之一，也是威脅我國小麥生產的一種常見病害，在我國 各地普遍發生，是生產中的主要病害。白粉病主要危害小麥的葉片，嚴重時也可危害莖桿和 穗部，近年來，會對小麥生產造成5-10 %的減產，嚴重時減產可達30-50 %。其由于近年來 我國矮桿和半矮桿品種的推廣，施肥灌溉水平的提高，以及田間種植密度的加大，小麥白粉 病有加大的趨勢，成為一種嚴重制約小麥生產的病害。通過適當的田間栽培管理措施，可以 一定程度上防治小麥白粉病。如綜合考慮小麥品種特性、土壤的肥力和當地的氣候條件，適 當控制株數，合理施肥，麥收后及時翻耕滅茬，以消滅越夏的菌源。盡管通過栽培管理措施 的改進可以一定程度上防治小麥白粉病，但是實踐證明，防治小麥白粉病最經濟、有效、環 保的方法是培育抗白粉病的小麥品種。而小麥白粉病抗病基因的鑒定、定位和克隆，是培育 抗病品種的重要基礎，因此挖掘新的抗白粉病基因資源具有重要意義。
[0003] MLO型抗病基因是植物特異的一類抗病基因。研究者最早發現ML0(Mildew resistance locus 2)基因對白粉病抗性是始于1937-1938年，由德國人在埃塞俄比亞采集 了很多品種的大麥，其中的兩個株系對白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.hordei)所有 已知的生理小種都具有高效抗性。進一步研究表明，大麥中MLO基因的隱性突變mlo可以 使大麥對幾乎所有已知大麥白粉病菌的生理小種產生持久、廣譜的抗性。最近，研究者發現 很多植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根 等等。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因對植物抗白粉病育種具有重要的作用。
[0004] 目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有圖位克隆，轉座子標簽等方法。但是由于小 麥的基礎研究不夠深入，因此利用這些方法不僅時間長而且很難準確地克隆這些基因。因 此，如何快速鑒定小麥中的MLO型抗病基因將成為小麥抗白粉病育種的重要前提。
[0005] 植物比較基因組學（Comparative Genomics)是基于基因組圖譜和測序基礎上，對 已知的基因和基因組結構進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利 用模式植物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結構上的同源性，克隆其他植物基 因，揭示基因功能和分子機制，闡明物種進化關系及基因組的內在結構。本專利所采用的方 法及思路：模式植物擬南芥基因組研究已經揭示了 MLO型基因的功能，利用基因其順序上 的同源性克隆小麥MLO型抗病基因，根據模式植物擬南芥實驗系統上的優越性和已知MLO 型抗病基因的特點，快速"捕捉"小麥抗白粉病基因。本專利應用比較基因組學、遺傳學、基 因組學、生物信息學和基因策略等知識，快速挖掘白粉病基因。
【發明內容】
[0006] 技術問題
[0007] 本發明的目的是提供一種通過結合植物比較基因組學、植物遺傳學、基因組學和 生物信息學等知識，快速挖掘小麥抗白粉病基因。其結果一方面可用于小麥白粉病基因緊 密連鎖分子標記的開發，進行分子標記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因 鑒定提供參考依據。
[0008] 技術方案
[0009] 主要原理：第一個植物抗白粉病基因（MLO)是從大麥中克隆的，研究發現此基因 是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數NBS(nucleotide-binding site)類型抗 病基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因， 研究發現這些基因編碼的都是MLO型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗證實MLO 型抗病基因已經成為植物特有的一類抗白粉病基因。進一步發現，植物MLO類型基因是一 個基因家族；而且對來源于不同物種的MLO基因家族進行系統發育關系分析發現，不同物 種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類MLO基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。小麥基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借 助于已經克隆的小麥MLO基因家族和已經克隆的MLO白粉病基因的系統發育關系以及對于 維持白粉病基因 MLO重要功能的氨基酸保守性來鑒定小麥白粉病基因。
[0010] 主要步驟如下：
[0011] 1)小麥MLO型基因的采集
[0012] 利用已經公布的MLO型基因序列，對NCBI基因組數據庫進行BLAST比對，獲得基 因序列。
[0013] 2)小麥MLO型基因家族的鑒定
[0014] 將上述結果中得到的同源核苷酸序列的基因，通過Pfam(E-Value=LO)進行分 析，去除無 'ML0'結構域的基因序列（圖1)。再將抗病基因序列通過MEGA3. 1軟件提供的 ClustalW工具（多序列比對程序）進行多序列比對，去除重復序列。
[0015] 3)通過植物MLO型基因的系統發育關系鑒定小麥MLO型白粉病基因
[0016] 由于先前的研究已經證明，雙子葉植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系統 發育樹同一區組，因此在系統發育關系研究中，我們把擬南芥的MLO型基因家族和一些其 他作物的MLO型抗白粉病基因和小麥MLO型基因一起聚類分析，以獲得小麥抗白粉病基因 (圖 2)。
[0017] 4)小麥白粉病基因與已知的植物MLO白粉病基因的比對
[0018] 利用BioXM2. 6軟件將小麥MLO型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的MLO 白粉病基因的氨基酸序列轉換成Fasta格式的文件，將這些文件導入BioEdit7. 0軟件，運 用此軟件中Clustal軟件進行多序列比對，揭示白粉病基因重要氨基酸殘基及區域的保守 性。從而進一步鑒定小麥白粉病基因（圖3)。
[0019] 本發明的積極效果：
[0020] 1)縮短了小麥白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規方 法（圖位克隆、轉座子標簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本 發明基于植物比較基因組學、遺傳學、生物信息學方法快速挖掘小麥白粉病基因，不僅可以 縮短時間，還可以提高白粉病基因鑒定效率。
[0021] 2)小麥（Triticum aestivum)是全世界重要樹木之一。由于小麥遺傳基礎狹窄， 種質資源多樣性低，因此通過常規的分子標記（RAPD、ISSR、SSR、AFLP等）鑒定小麥白粉病 基因比較困難。通過鑒定的白粉病基因開發相應的共分離功能性標記（SNP、SCAR等），可 以快速的用于抗病基因的分子標記輔助選擇，進行多抗性育種材料的創制，可以縮短育種 年限，提1?育種效率。
[0022] 3)為闡述小麥抗白粉病分子機制奠定了基礎。小麥抗白粉病基因的鑒定，通過轉 基因技術、RNAi、病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技術等研究 抗白粉病的分子機制提供了基因資源，有利于快速闡述小麥抗白粉病的作用機理。
【附圖說明】
[0023] 圖1小麥MLO基因的鑒定；
[0024] 本圖顯示的是13個MLO型基因鑒定結果，每一個基因都含有一個'ML0'保守結構 域。
[0025] 圖2植物MLO基因家族的系統發育關系分析及其小麥MLO型白粉病基因的鑒定；
[0026] 擬南芥是植物科學研究的模式植物，在構建系統發育樹中，擬南芥的15個MLO型 基因（其中3個基因是白粉病基因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (SMLO)、大麥白粉病基因（HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被選擇用來和 小麥MLO型基因聚類分析。共鑒定出7個小麥MLO型白粉病基因。圖中斜體標記的基因就 是小麥白粉病基因。
[0027] 圖3小麥MLO型白粉病基因的比對分析；
[0028] 7個小麥白粉病基因與大麥（HvMLO)、番茄（SMLO)、豌豆（PsMLO)、擬南芥白粉病 基因（AtML002, AtML006和AtML012)進行比對，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基 和區域的保守型。圖中TM1-TM7表示小麥MLO型白粉病基因的7個轉模區域；黑色圓點表 示白粉菌侵染重要的氨基酸殘基；CaMBD表示鈣調蛋白結合區；I和II表示對白粉菌侵染 重要的氨基酸區域。
【具體實施方式】
[0029] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出小麥白粉病基因。具體實施過程如下：
[0030] 1)小麥MLO型基因的采集
[0031] 為了獲得小麥MLO型基因成員，我們首先以擬南芥的MLO型基因，番茄、豌豆、辣 椒、薔薇、辣椒、百脈根的抗白粉病MLO基因序列從NCBI數據庫中檢索小麥MLO型基因； 其次以不同作物中已經發表的MLO基因序列作為靶序列（來自DFCI數據庫：TC171015， TC267529, DFCI：TC327983, TC289653, TC312087, TC132500, TC133436, TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC315944, TC315912, TC322759, TC322059, TC330654, TC282713, TC293173, TC281861, TC283253, TC283383, TC285032, TC290021, TC302716, TC283487, TC282866, TC283441， TC281428, TC285118, TC285090 ;來自 GenBank 數據 庫：AY967408, AF384145, AF384144, AY029312-AY029315, AY029317-AY029319, Z95352， AF369563-AF369565, AF369567, AF369569-AF369576, Z83834, Z95496, AY581255)，對小麥數 據庫（http : // www. ncbi. nlm. nih. gov /)進行BLAST比對，選擇相似度最高的序列進行 下載，共獲得了 13 條的 MLO 型基因（AB581575 ;AB581579 ;AB581576 ;AB581580 ;AB581577 ; AB581578 ；AF361932 ；AF361933 ；AY584534 ；AF384144 ；AF384145 ；GQ397361 ：GQ397362) 〇
[0032] 2)小麥MLO型基因保守結構域的鑒定
[0033] 為了進一步驗證這些MLO基因準確性，我們對這13個MLO基因進行保守結構域 "ML0"的鑒定。以每一個的MLO型基因的氨基酸序列為基準，在PFAMQittp: //pfam. sanger.ac.uk /)網站上進行'ML0'保守結構域的鑒定，結果表明，每一個MLO型基因都具 有一個或者多個'ML0'結構域（圖1)。
[0034] 3)小麥MLO型基因的系統發育關系分析
[0035] 在先前的研究中，發現雙子葉植物白粉病基因聚合成一個區組；因此，在構建系 統發育樹中，我們選擇了模式植物擬南芥的15個MLO型基因（其中3個基因是白粉病基 因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因、大麥白粉病基因和豌豆的白粉病 基因和小麥MLO型基因聚類分析一起聚類分析。將小麥MLO型基因和其他作物白粉病基 因蛋白質序列進行多序列聯配（采用Clustal XI. 83軟件進行），并利用Genedoc軟件 (http: // www.nrbsc