甜瓜mlo型抗白粉病基因快速鑒定的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明是借助于甜瓜測序全基因組序列，利用植物比較基因組學、遺傳學、生物信 息學和候選基因策略等方法快速鑒定甜瓜白粉病基因，主要涉及到甜瓜全基因組序列的下 載，候選基因的鑒定，基因的比對，聚類等手段，進而鑒定出白粉病基因，屬于植物生物技術 科學領域。
【背景技術】
[0002] 甜瓜又稱甘瓜或香瓜。甜瓜因味甜而得名，由于清香襲人故又名香瓜。甜瓜是夏令 消暑瓜果，其營養價值可與西瓜媲美。據測定，甜瓜除了水分和蛋白質的含量低于西瓜外， 其他營養成分均不少于西瓜，而芳香物質、礦物質、糖分和維生素 C的含量則明顯高于西 瓜。多食甜瓜，有利于人體心臟和肝臟以及腸道系統的活動，促進內分泌和造血機能。祖國 醫學確認甜瓜具有"消暑熱，解煩渴，利小便"的顯著功效。白粉病嚴重危害甜瓜的生產，從 苗期到收獲期均可受害，尤以生長后期受害最重。主要為害葉片。初在葉面上現白色霉斑， 后漸向四周擴展，形成近圓形斑塊，條件適宜時，霉斑擴展十分迅速，病斑相互融合成一片， 致整個葉片覆滿一層白粉狀物，嚴重的瓜面上也可長出白色粉狀物。目前在生產中，甜瓜白 粉病的防治主要靠噴灑殺菌劑，但長期使用藥物會導致環境污染和病菌生理小種變異，因 此推廣抗病品種是最安全有效的方法。
[0003] MLO型抗病基因是植物中一類特異的抗病基因。研究者最早發現MLO基因對白粉 病抗性是始于1937-1938年，德國人在埃塞俄比亞采集了很多品種的大麥，其中的兩個株 系對白粉病菌（Blumeria.graminisf.sp.hexlei，Bgh)所有已知的生理小種都具有高效抗 性。進一步研究表明，大麥中MLO基因的隱性突變mlo可以使大麥對幾乎所有已知大麥白 粉病菌的生理小種產生持久、廣譜的抗性。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因對植物抗白 粉病育種具有重要的意義。目前，克隆植物抗病基因的方法主要有轉座子標簽法、圖位克隆 法等。因此，如何快速鑒定甜瓜的MLO型抗病基因將成為甜瓜抗白粉病育種的重要前提。
[0004] 植物比較基因組學（Comparative Genomics)是基于基因組圖譜和測序獲得的信 息推測其他生物基因組的基因數目、位置、功能、表達機制和物種進化的學科。利用模式植 物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結構上的同源性，克隆其他植物基因，揭示 基因功能和分子機制，闡明物種進化關系及基因組的內在結構，能夠更快的推進對可可樹 的白粉病的防治。植物比較基因組學的重要性在于它把不同的學科、不同的生物種類聯系 在一起，架起了基礎研究和應用研究之間的橋梁。跨種、跨屬、跨界的基因組比較對我們了 解基因及基因組的結構、基因結構與功能的關系及DNA變化如何導致生物多樣性等有十分 重要的意義。
[0005] 本專利所采用的方法及思路：模式植物擬南芥基因組研究已經揭示了 MLO型基因 的功能，利用基因其順序上的同源性克隆甜瓜MLO型抗病基因，根據模式植物擬南芥實驗 系統上的優越性和已知MLO型抗病基因的特點，快速"捕捉"甜瓜抗白粉病基因。本專利介 紹了以甜瓜全基因組序列為前提，結合比較基因組學、遺傳學、基因組學、生物信息學和候 選基因策略等知識，快速挖掘白粉病基因。
【發明內容】
[0006] 技術問題
[0007] 本發明的目的是提供一種通過結合植物比較基因組學、植物遺傳學、基因組學和 生物信息學等知識，快速挖掘甜瓜抗白粉病基因。其結果一方面可用于甜瓜白粉病基因緊 密連鎖分子標記的開發，進行分子標記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因 鑒定提供參考依據。
[0008] 技術方案
[0009] 主要原理：第一個植物抗白粉病基因（MLO)是從大麥中克隆的，研究發現此基因 是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數NBS(nucleotide-binding site)類型抗 病基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因， 研究發現這些基因編碼的都是MLO型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗證實MLO 型抗病基因已經成為植物特有的一類抗白粉病基因。進一步發現，植物MLO類型基因是一 個基因家族；而且對來源于不同物種的MLO基因家族進行系統發育關系分析發現，不同物 種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類MLO基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。甜瓜基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借 助于已經測序的甜瓜全基因組中MLO基因家族和已經克隆的MLO白粉病基因的系統發育關 系以及對于維持白粉病基因 MLO重要功能的氨基酸保守性來鑒定甜瓜白粉病基因。
[0010] 主要步驟如下：
[0011] 1)甜瓜全基因組序列的下載及其MLO型基因的采集
[0012] 首先從甜瓜測序基因組數據庫（http: // melonomics.net /)下載甜瓜全基因 組序列；使用"DNAT00LS"軟件對獲得的甜瓜全基因組氨基酸序列數據建立數據庫，然后用 pfam 數據庫（蛋白家族數據庫，http: // pfam.janelia.org/search / sequence)中的 隱馬爾可夫模型（HMM)對MLO結構域的氨基酸序列與已建立的甜瓜全基因組氨基酸序列數 據庫進行Blastp (E-value=0. 001)序列比對，初步篩選出候選基因序列。其次，利用已經公 布的MLO型基因序列，對甜瓜基因組數據庫進行BLAST比對，獲得候選基因序列。
[0013] 2)甜瓜MLO型基因家族的鑒定
[0014] 將上述結果中得到的同源氨基酸序列的候選基因，通過Pfam(E-Value=LO)進行 分析，去除無 'ML0'結構域的基因序列（圖1)。再將候選抗病基因序列通過MEGA3. 1軟件 提供的ClustalW工具（多序列比對程序）進行多序列比對，去除重復序列。
[0015] 3)通過植物MLO型基因的系統發育關系鑒定候選的甜瓜MLO型白粉病基因
[0016] 由于先前的研究已經證明，雙子葉植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系統 發育樹同一區組，因此在系統發育關系研究中，我們把擬南芥的MLO型基因家族和一些其 他作物的MLO型抗白粉病基因和甜瓜MLO型基因一起聚類分析，以獲得候選的甜瓜抗白粉 病基因（圖2)。
[0017] 4)甜瓜白粉病基因與已知的植物MLO白粉病基因的比對
[0018] 利用Bi〇XM2. 6軟件將甜瓜候選的MLO型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的 MLO白粉病基因的氨基酸序列轉換成Fasta格式的文件，將這些文件導入Bi〇Edit7. 0軟件， 運用此軟件中Clustal軟件進行多序列比對，揭示候選白粉病基因重要氨基酸殘基及區域 的保守性。從而進一步鑒定甜瓜候選的白粉病基因（圖3)。
[0019] 本發明的積極效果：
[0020] 1)縮短了甜瓜白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規方 法（圖位克隆、轉座子標簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本 發明基于植物比較基因組學、遺傳學、生物信息學方法快速挖掘甜瓜白粉病基因，不僅可以 縮短時間，還可以提高白粉病基因鑒定效率。
[0021] 2)甜瓜（Cucumis melo)是全世界重要蔬菜之一。由于甜瓜遺傳基礎狹窄，種質資 源多樣性低，因此通過常規的分子標記（rapd、issr、ssr、aflp等）鑒定甜瓜白粉病基因比 較困難。通過鑒定的候選白粉病基因開發相應的共分離功能性標記（SNP、SCAR等），可以 快速的用于抗病基因的分子標記輔助選擇，準確性高。
[0022] 3)多抗性育種材料的創制。基于新鑒定的白粉病基因開發的功能性分子標記，結 合已經定位的其他抗病基因的分子標記，進行多抗性育種材料的創制，可以縮短育種年限， 提1?育種效率。
[0023] 4)為闡述甜瓜抗白粉病分子機制奠定了基礎。甜瓜抗白粉病基因的鑒定，通過轉 基因技術、RNAi、病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技術等研究 抗白粉病的分子機制提供了基因資源，有利于快速闡述甜瓜抗白粉病的作用機理。
【附圖說明】
[0024] 圖1甜瓜MLO基因的鑒定；
[0025] 本圖顯示的是14個MLO型基因鑒定結果，每一個基因都含有一個'ML0'保守結構 域。
[0026] 圖2植物MLO基因家族的系統發育關系分析及其甜瓜MLO型白粉病基因的鑒定；
[0027] 擬南芥是植物科學研究的模式植物，在構建系統發育樹中，擬南芥的15個MLO型 基因（其中3個基因是白粉病基因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (SlMLO)、大麥白粉病基因（HvMLO)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被選擇用來和甜瓜MLO型 基因聚類分析。共鑒定出3個甜瓜候選的MLO型白粉病基因。圖中斜體標記的基因就是候 選甜瓜白粉病基因。
[0028] 圖3甜瓜MLO型白粉病基因的比對分析；
[0029] 3個甜瓜白粉病基因與大麥（HvMLO)、番茄（SlMLO)、豌豆（PsMLO)、擬南芥白粉病 基因（AtML002, AtML006和AtML012)進行比對，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基 和區域的保守型。圖中TM1-TM7表示甜瓜MLO型白粉病基因的7個轉模區域；黑色圓點表 示白粉菌侵染重要的氨基酸殘基；CaMBD表示鈣調蛋白結合區；I和II表示對白粉菌侵染 重要的氨基酸區域。
【具體實施方式】
[0030] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出甜瓜白粉病基因。具體實施過程如下：
[0031] 1)甜瓜MLO型基因的采集及鑒定
[0032] 為了獲得甜瓜全部的MLO型基因家族成員，我們首先以擬南芥的MLO型基因，番 茄、豌豆、辣椒、薔薇、辣椒、百脈根的抗白粉病MLO基因序列構建HMM模型，從甜瓜基因組序 列中收索MLO型基因；其次以不同作物中已經發表的MLO基因序列作為靶序列（來自DFCI 數據庫：TC171015, TC267529, DFCI :TC327983, TC289653, TC312087, TC132500, TC133436， TC317623, TC317025, TC315947,