酯酶及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種酯酶及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯是化學酶法合成普瑞巴林 (Pregabalin，簡稱PGB，商品名為Lyrica K )的重要手性中間體。普瑞巴林是一種神經遞質 γ-氨基丁酸（GABA)的三位異丁基取代物，其作為新一代抗癲癇藥物，已被應用于治療多 種中樞神經系統紊亂疾病，包括神經病理性疼痛，社交性焦慮障礙，泛發性焦慮癥和輔助性 治療局限性部分癲癇發作等。由于該藥物相較于其他同類治療癲癇病藥物具有明顯的優 勢，由輝瑞公司生產并上市銷售的Lyrica".年銷售額呈逐年攀升之勢，在2011年、2012年和 2013年分別高達36. 9億、41. 6億和46. 0億美元。由于只有S構型的普瑞巴林具有藥理活 性，因此，獲取光學純的中間體2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯在有效減少服用 劑量、提高治療窗口、減輕非活性對映體所致副作用等方面具有重要的意義。
[0003] 制備普瑞巴林主要有兩類方法：一類是使用不對稱催化劑、手性配體或者以手性 化合物為原料的不對稱合成法，另一類是使用化學手性拆分劑或者生物酶對外消旋反應中 間體或外消旋普瑞巴林進行拆分的外消旋體拆分法。不對稱合成法因需要昂貴的手性試 劑，特殊的設備，苛刻的反應條件等，其應用受到了明顯的限制。化學拆分法同樣具有一些 難以避免的缺陷，譬如反應步驟繁雜，勞動強度大，操作復雜，收率低，環境污染較大等。相 比之下，生物拆分法則可有效避免這些問題，具備操作條件簡單溫和，對映選擇性強，成本 低，環境友好等優點，因此具有極大的開發潛力和廣闊的應用前景。
[0004] 目前，不少生物催化法制備普瑞巴林的途徑已見報道。例如，具有高活力和高對映 體選擇性（轉化率為45 %，產物對映體過量值eeps 98% )的腈水解酶AtNitL能夠實現 高效地立體選擇性水解異丁基琥珀腈，得到中間體（3S)-3-氰基-5-甲基己酸。來自南極 假絲酵母的脂肪酶CALB也被應用于立體選擇性合成手性中間體（S)-或（R)-異丁基-戊 二酸酯（收率為96%，ee值為95. 5% )。基于過程效率和產品成本的考慮，這些路徑目前 并不能滿足制備普瑞巴林的工業化應用要求。
[0005] 另外一條路徑，即輝瑞公司利用商業脂肪酶Lipolascκ:選擇性地水解2-羧乙 基-(S)_3-氰基-5-甲基己酸乙酯，則成功實現了化學-酶法制備普瑞巴林的工業化生 產。該方法所得到的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸（轉化率為45 % -50%，ee值 >98%)的鈉鹽，經過后續化學反應步驟最終可制得（S)-普瑞巴林。這條工藝路線實現了 手性中心的盡早確立以及2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的外消旋化再利用，大 幅地減少了原料用量和廢棄物產生量，使E因子由第一代（傳統拆分）路線的86降至8。 基于這條生物法拆分路線，其他作用于2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯的酶或微 生物陸續被開發和報道。如一株土篩得到的菌株KM8經紫外和硫酸二甲酯（DES)誘變，其 轉化率和ee p值分別提高至76. 1 %和92. 6%。另一株菌Morgarella morganii ZJB-09203 及從中純化得到的酯酶也被應用于選擇性水解2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯， 當使用全細胞催化劑水解I. 5M底物時，其轉化率和的^直分別為45. 3 %和95%。來源于 Thermomyces Ianuginosus的脂肪酶Lip經過定點突變改造，酶活得到大幅提高，在IM底物 投入量下實現了 42. 4%的轉化率和98%的的^直。然而，上述路線的酶法拆分都無法獲取 更高光學純度（ee > 99% )的S型產物。
[0006] 因此，通過對映選擇性水解2-羧乙基_(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯而留下未被 水解的高光學純度2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯是一種具有潛力的拆分選擇。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種酯酶及其編碼基因和應用，該酯酶具有高表達量、高選擇性和 手性選擇性的特點。
[0008] 本發明提供了一種酯酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 該酯酶（命名為EstZF172)是從假單胞菌Pseudomonas CGMCC NO. 4184中克隆獲 得，由1146個堿基組成，能夠催化酯酶水解生成酸和醇。
[0010] 本發明還提供了一種編碼所述的酯酶的基因。
[0011] 作為優選，所述的基因的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 本發明提供了一種包含所述基因的表達盒、重組載體和轉化子。
[0013] 本發明還提供了一種所述的酯酶在催化酯類水解中的應用。
[0014] 具體地，所述的酯酶在催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制備 2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的應用。
[0015] 本發明還提供了一種制備2-羧乙基_(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的方法，包括 以下步驟：
[0016] (1)制備包含所述基因的工程菌的靜息細胞懸液；
[0017] (2)往靜息細胞懸液中添加 rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯進行水解反 應，經后處理，得到2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
[0018] 所述的水解反應如下式所示：
[0019]
【主權項】
1. 一種酯酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -種編碼權利要求1所述的酯酶的基因。
3. 如權利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的堿基序列如SEQ ID NO. 1所 不O
4. 一種包含權利要求2或3所述基因的表達盒、重組載體和轉化子。
5. 如權利要求1所述的酯酶在催化酯類水解中的應用。
6. 如權利要求1所述的酯酶在催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制 備2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的應用。
7. -種制備2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的方法，包括以下步驟： (1) 制備包含權利要求2所述基因的工程菌的靜息細胞懸液； (2) 往靜息細胞懸液中添加 rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯進行水解反應， 經后處理，得到2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
8. 如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸 乙酯與靜息細胞的質量比為20?60 : 1。
9. 如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述水解反應的溫度為20?55°C。
10. 如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，水解反應過程中離子緩沖液的pH值為 5 ?10. 5〇
【專利摘要】本發明公開了一種酯酶及其編碼基因和應用，該酯酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本發明從假單胞菌Pseudomonas？CGMCC？NO.4184中克隆得到酯酶基因，該基因表達后獲得的酯酶具有高表達量、高選擇性和手性選擇性的特點；本發明將包含酯酶基因的工程菌應用到催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制備2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中，能夠控制反應的轉化率在超過50％時，即可獲得未被水解的高純度2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
【IPC分類】C12P13-00, C12N15-55, C12N15-70, C12N9-18, C12N1-21
【公開號】CN104560912
【申請號】CN201510005882
【發明人】楊立榮, 許方馨, 吳堅平, 徐剛
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月6日