GLP-1類似物和amylin類似物的融合蛋白制備及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種新型融合蛋白的制備及其用途。
【背景技術】
[0002] 血糖的穩態受胰島素和體內多種激素嚴密調節，對維持機體的正常功能具有重要 作用。然而，由于胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙將導致以高血糖為特征的代謝性 疾病。持續高血糖與長期代謝紊亂等可導致全身組織器官，特別是眼、腎、心血管及神經 系統的損害及其功能障礙和衰竭。其中體內天然存在的調節胰島素和血糖水平的激素有 GLP-I (glucagon-like peptide-1，GLP-1)和amylin，兩種激素的類似物已開發成臨床用 藥，如GLP-I類似物"百泌達"（Byetta，Amylin制藥）和"諾和力"（Victoza，諾和諾德制 藥）以及amylin類似物"普蘭林肽"（Pramlintide, Amylin制藥）。臨床藥物試驗表明，這 些藥物能調節胰島素的產生和作用以及其它相關激素水平，可控制體內血糖水平，從而達 到預防和治療以高血糖為特征的代謝性疾病。但是，3種藥物均需一日一次或多次注射給 藥，患者的依從性并不令人滿意，目前，已有多種長效制劑在開發中，如Amylin制藥公司的 長效注射劑Bydureon和禮來制藥公司的GLP-I類似物Dulaglutide (LY2189265)均為每周 1次注射，用于治療2型糖尿病。
[0003] GLP-I主要通過刺激胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌發揮調節血糖的作用，同 時，GLP-I也能抑制P細胞凋亡，促其再生；GLP-I也能減慢胃排空速度，并通過作用下丘 腦，抑制食欲。Amylin是一種由37個氨基酸殘基構成的多肽激素，與胰島素共分泌自胰腺 3細胞，主要生理功能為減緩胃排空和延遲葡萄糖吸收，還通過抑制胰高血糖素減少肝糖 的產生，減少食欲，輔助胰島素調節血糖水平。Amylin類似物"普蘭林肽"輔助胰島素治療 糖尿病的療效已得到證實；近年來，Amylin類似物的療效尤其對肥胖型糖尿病的療效備受 關注。GLP-I和Amylin在體內均能調節血糖水平，但二者在功能上有所不同，作用可以互 補。James L.Trevaskis(PLOS ONE ;0ctober2013，Volume8，Issuel0)等人以化學合成的方 式將二者融合，擬行使兩種激素的生理作用。動物實驗表明，融合肽優于兩種肽類激素單獨 作用的效果，在降低體重的效果尤為顯著。由于該融合肽分子仍然偏小，易于被體內蛋白酶 降解或腎小球濾過，導致體內半衰期短，因而限制了其臨床應用的價值。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種GLP-I類似物和Amylin類似物的融合蛋白，該融合蛋白 針對現有技術中GLP-I類似物或Amylin類似物以及二者的化學融合其半衰期短，需每天 注射等缺陷而設計，該融合蛋白具有GLP-I和Amylin的雙重生理活性，且具有長效功能，可 實現協同降糖同時伴隨體重下降的作用。
[0005] 本發明提供的融合蛋白由DNA重組技術或基因工程手段實現，并由以下通式表 示：
[0006] X-連接肽-X-連接肽-IgG Fc片段-Y-連接肽-Y ;其中，X為GLP-I類似物；連接 肽為（GGGGS) n ;Y為Amylin類似物。
[0007] 本發明提供的融合蛋白，由GLP-I類似物、Amylin類似物與人免疫球蛋白Fc片段 連接形成融合蛋白，其具體序列如下：
[0008] GLP-I類似物的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :1所述；
[0009] Amylin類似物的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :3所述；
[0010] IgGlFc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :5所述；
[0011] IgG2Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :7所述；
[0012] IgG3Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :9所述；
[0013] IgG4Fc的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO :11所述。
[0014] 融合蛋白GIA的氨基酸如序列表中的SEQ ID NO : 13所述
[0015] 編碼所述上述融合蛋白核苷酸序列如下：
[0016] GLP-I類似物的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :2所述；
[0017] Amylin類似物的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :4所述；
[0018] IgGlFc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :6所述；
[0019] IgG2Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO :8所述；
[0020] IgG3Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO : 10所述；
[0021] IgG4Fc的核苷酸如序列表中的SEQ ID NO : 12所述；
[0022] 融合蛋白GIA核苷酸如序列表中的SEQ ID NO : 14所述。
[0023] 本發明同時提供了上述核酸序列的表達載體，其能在轉化的宿主細胞中復制表 達。
[0024] 本發明還提供了一種制備融合蛋白的方法，將上述表達載體引入合適的表達系 統，從而進行融合蛋白的表達。
[0025] 本發明進一步提供了一種藥物組合物，其由上述融合蛋白與藥學上可接受的載體 或賦形劑組成；所述藥物組合物的制劑形式優選為注射劑、注射用凍干粉針。
[0026] 本發明還提供了上述融合蛋白在制備預防和治療高血糖癥、2型糖尿病、1型糖尿 病、葡萄糖耐量降低、肥胖癥、高血壓、代謝綜合癥、血脂障礙、認知障礙、心肌梗賽、冠心病 和其它心血管疾病、中風、消化不良等疾病藥物中的用途。
[0027] 本發明融合蛋白的表達載體，可以是重組真核表達載體，優選哺乳動物細胞表達 載體；也可以是重組病毒表達載體，優選腺相關病毒或腺病毒載體。
[0028] 含有表達上述融合蛋白的宿主細胞，可以為CHO細胞及其亞系或293細胞及其亞 系。
【附圖說明】
[0029] 圖I G/A融合蛋白對胰島RIN-5F細胞cAMP生成的影響
【具體實施方式】
[0030] 提供以下實施例對本發明作進一步闡釋。應當理解，這些實施例僅用于說明本發 明而非對本發明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發明實施中所作的 任何變動都將落在權利要求書的范圍內。
[0031] 實施例1融合蛋白的制備
[0032] 1、質粒構建
[0033] I. 1基因和引物合成
[0034] 表達序列通過下述合成的基因和引物重組至表達載體。基因和引物由專業公司北 京金唯智公司合成，合成基因序列重組至質粒載體PUC19中。
[0035] 合成融合蛋白基因片段：
【主權項】
1. 一種GLP-I類似物和amylin類似物的融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式表示： X-連接肽-X-連接肽-IgG Fc片段-Y-連接肽-Y ;其中，X為GLP-I類似物；連接肽為 (GGGGS)η ;Y 為 Amylin 類似物。
2. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其中蛋白X為GLP-I類似物；其氨基酸序列為SEQ ID NO :1，或由在所述氨基酸序列中的任何一個中一個或幾個氨基酸被刪除，添加和/或取 代的氨基酸序列組成。
3. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其中蛋白Y為Amylin類似物；其氨基酸序列為SEQ ID NO :3,或由在所述氨基酸序列中的任何一個中一個或幾個氨基酸被刪除，添加和/或取 代的氨基酸序列組成。
4. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其中連接肽含有由式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) η(式中，η是1?4的整數），表示的氨基酸序列。
5. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其中IgG Fc片段為IgGlFc片段、IgG2Fc片段、 IgG3Fc片段和IgG4Fc片段，；其氨基酸序列為分別SEQ ID NO :5、7、9、11。
6. 權利要求1所述的融合蛋白，其中融合蛋白由SEQ ID N0:13的氨基酸序列組成，或 由在SEQ ID NO: 13的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸被刪除，添加和/或取代的氨基酸序 列組成。
7. -種制備融合蛋白的方法，其特征在于將權利要求1所述的融合蛋白編碼DNA插入 表達載體，并將此載體引入合適的表達系統，并進行融合蛋白的表達。
8. -種藥物組合物，其特征在于由權利要求1中任一項所述融合蛋白與藥學上可接受 的載體或賦形劑組成。
9. 根據權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的制劑形式為注射 齊U、注射用凍干粉針。
10. 預防和治療高血糖癥、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖癥、高血壓、 代謝綜合癥、血脂障礙、認知障礙、心肌梗賽、冠心病和其它心血管疾病、中風、消化不良，其 特征在于，含有權利要求1的融合蛋白作為有效成分。
【專利摘要】本發明公開了一種GLP-1類似物和amylin類似物的融合蛋白制備方法及其應用。本發明所述的融合蛋白其通式表示為：X-連接肽-X-連接肽-IgG？Fc片段-Y-連接肽-Y；其中，X為GLP-1類似物；連接肽為(GGGGS)n；Y為Amylin類似物。本發明所提供的融合蛋白具有兩種蛋白生理活性，同時具有比單獨使用更好的穩定性和持續性，使其在治療糖尿病、肥胖癥、代謝綜合癥以及心血管疾病等方面具有明顯的優勢和良好的前景。
【IPC分類】A61K38-26, A61P3-04, A61P9-10, A61P25-00, A61P1-14, C07K19-00, A61P3-06, A61K38-22, A61P3-00, A61P3-10, A61P9-00, C12N15-63, A61P9-12
【公開號】CN104558198
【申請號】CN201410357012
【發明人】高小平, 李生偉, 付偉
【申請人】成都貝愛特生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年7月25日