一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽，本發明還涉及該孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]孔鰩(敘/a為鰩科鰩屬的魚類，俗稱勞板魚、勞子、甫魚等，分布于北太平洋西部，中國東海、南海及黃海、渤海均產之。孔鰩肉多刺少，無硬骨，其肉可鮮食，但更多的是腌制加工成淡干魚。孔鰩魚干是遼寧、山東等省沿海居民習慣而喜食的水產品。
[0003]目前，申請人研究發現，以孔鰩魚肉為原料，利用酶解技術制備抗氧化多肽的工藝研究尚處于空白階段，而以酶解產物為材料制備高活性抗氧化多肽及其應用更是未見報道。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的第一個技術問題是針對上述的技術現狀提供一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽，該多肽可有效清除羥基自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和超氧陰離子自由基。
[0005]本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽的制備方法。
[0006]本發明所要解決的第三個技術問題是提供一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽在用于制備抗氧化藥物或保健食品中的用途。
[0007]本發明為解決上述第一個技術問題所采取的技術方案為:一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1 Ie-Trp-Asp(NWDMEKIffD ), ES I/MS 檢測分子量為 1236.38 Da。
[0008]本發明為解決上述第二個技術問題所采取的技術方案為:一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)孔鰩魚肉絞碎，按固液比Ig:4~6 mL加入異丙醇，于35~40 °〇脫脂處理1~2 h后，于9 000 r/min離心8~10 min,取沉淀,干燥,得脫脂孔鰩魚肉；
(2)將脫脂孔鰩魚肉按固液比Ig:4~6 mL加入磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L, pH 7.0),按照脫脂孔鰩魚肉質量的1.8-2.5%加入中性蛋白酶(酶活力彡1.5 AU/g)，于60~70°C溫度下酶解3~5 h ；
(3)將酶解液以10000 r/min于3~5°C下低溫離心20~25 min,去除沉淀,取上清液；上清液依次經超濾和層析，得到抗氧化多肽。
[0009]作為改進，所述步驟(3)的超濾和層析的具體過程為:
超濾:將上清液用截留分子量I kDa的超濾膜進行超濾處理，根據對羥基自由基的清除率，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解物；
層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成25~30 mg/mL的溶液，經過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.08-0.12 mol/L,0.45-0.55 mol/L 和 0.90-1.10 mol/L NaCl 溶液進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對羥基自由基清除率最高組分為離子交換層析酶解物；將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成20~25 mg/mL的溶液,經過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對羥基自由基清除率最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成90~100μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據對羥基自由基的清除率得 I 個高抗氧化活性多妝 Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp-Asp (NWDMEKIffD)?
[0010]優選，所述陰離子交換樹脂為纖維素DE-52，所述凝膠為葡聚糖凝膠G-15。
[0011]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量20~25 μ L ;色譜柱為Zorbax SB C_18(4.6X 250 mm);流動相:30%乙腈；洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
[0012]本發明為解決上述第三個技術問題所采取的技術方案為:一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽的應用，其特征在于 Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp-Asp (NWDMEKIWD)可以有效清除輕基自由基(EC5tl 0.176 mg/mL), DPPH自由基(EC5tl 0.289 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC5tl 0.132 mg/mL),可用于抗氧化方面的藥品或保健食品。
[0013]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明將生物酶解法、膜超濾分級和色譜精制有效融合，制得的多肽具有顯著的自由基清除活性；與化學合成的抗氧化劑相比較，本發明制得的抗氧化多肽安全、高效、無毒副作用，可用作抗氧化方面的藥品或保健食品。
【附圖說明】
[0014]圖1是本發明的孔鰩魚肉蛋白超濾酶解物(SMH-1II)的陰離子交換樹脂(纖維素DEAE-52)層析圖。
[0015]圖2是本發明的孔鰩魚肉蛋白酶解物的陰離子交換層析分離組分(Fr.5)的葡聚糖凝膠G-15層析圖。
[0016]圖3是本發明的孔鰩魚肉蛋白酶解物的葡聚糖凝膠G-15制備酶解物(Fr.5_3)的RP-HPLC分析圖。
[0017]圖4 是本發明的 Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp-Asp 的質譜(ES1-MS)圖和結構式。
【具體實施方式】
[0018]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0019]一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽的制備方法，制備工藝流程如下:孔鰩魚肉〃蛋白脫脂"酶解物"超濾"離子交換層析"凝膠過濾層析"高效液相色譜制備"抗氧化多肽。
[0020]實施例:
(1)孔鰩魚肉絞碎，按固液比Ig:5 mL加入異丙醇，于35 °〇脫脂處理2 h后，于9 000r/min離心8 min,取沉淀,干燥,得脫脂孔鰩魚肉；
(2)將脫脂孔鰩魚肉按固液比Ig:6 mL加磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L, pH 7.0)，按照脫脂孔鰩魚肉質量的2%加入中性蛋白酶(酶活力彡1.5 AU/g)，于60°C溫度下酶解5 h ；
(3)將酶解液以10000 r/min于4°C下低溫離心20 min，去除沉淀，取上清液；上清液依次經超濾和層析，得到抗氧化多肽，利用氨基酸序列分析和質譜測定其結構，具體過程為:
①超濾:將上清液用截留分子量IkDa的超濾膜進行超濾處理，根據對羥基自由基的清除率，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解物；
②陰離子交換層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成25mg/mL的溶液,經過陰離子交換樹脂纖維素DE-52分離，用雙蒸水、0.10 mol/L、0.50 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對羥基自由基清除率最高組分為離子交換層析酶解物(圖1)。
[0021]③凝膠過濾層析:將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成20 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠G-15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對羥基自由基清除率最高組分為凝膠層析酶解物(圖2)。
[0022]④高效液相色譜精制:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成100 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據對羥基自由基的清除率得I個高抗氧化活性多肽(圖3)。
[0023]⑤結構檢測:收集活性最高的I個抗氧化多肽經檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為 Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp-Asp (NWDMEKIWD), ESI/MS檢測分子量為1236.38 Da (圖4)。
[0024]將上述制得的孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp-Asp(NWDMEKIWD)進行自由基實驗。實驗結果表明:該多肽可有效清除羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基，半數清除率(EC5tl)分別為0.176 mg/mL,0.289 mg/mL和0.132 mg/
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[0025]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽，其特征在于該孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽的氨基酸序列為 Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1 I e-Trp-Asp，ES I/MS 檢測分子量為 1236.38 Da。
2.—種權利要求1所述的一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 預處理步驟:孔鰩魚肉絞碎，按固液比I g:4~6 mL加入異丙醇，于35~40 1:脫脂處理1~2 h后，于9 OOO r/min離心8~10 min,取沉淀,干燥,得脫脂孔鰩魚肉； 酶處理步驟:將脫脂孔鰩魚肉按固液比I g:4~6 mL加磷酸鹽緩沖液，按照脫脂孔鰩魚肉質量的1.8-2.5%加入中性蛋白酶，于60~70°C溫度下酶解3~5 h ； 提純步驟:將酶解液以10 000 r/min于3~5°C下低溫離心20~25 min，去除沉淀，取上清液；上清液依次經超濾和層析，得到抗氧化多肽； 酶處理步驟中,所述的中性蛋白酶酶活力> 1.5 AU/g ； 酶處理步驟中，所述的磷酸鹽緩沖液濃度為0.05 mol/L, pH為7.0。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述提純步驟的超濾和層析的具體過程為: 超濾:將上清液用截留分子量I kDa的超濾膜進行超濾處理，根據對羥基自由基的清除率，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解物； 層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成25~30 mg/mL的溶液，經過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.08-0.12 mol/L,0.45-0.55 mol/L 和 0.90-1.10 mol/L NaCl 溶液進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對羥基自由基清除率最高組分為離子交換層析酶解物；將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成20~25 mg/mL的溶液,經過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對羥基自由基清除率最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成90~100μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進行純化，根據對羥基自由基的清除率得I個高抗氧化活性多妝 Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1 Ie-Trp-Asp。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述陰離子交換樹脂為纖維素DE-52，所述凝膠為葡聚糖凝膠G-15 ;所述RP-HPLC條件為:進樣量20~25 μ L ;色譜柱為ZorbaxSB C-18,4.6 X 250 mm ;流動相:30%乙腈；洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
5.根據權利要求2所述的一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽的制備方法，其特征在于所制備的抗氧化多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp-Asp可有效清除輕基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基。
6.權利要求1所述的一種孔鰩魚肉蛋白多肽用于制備抗氧化藥物或保健食品中的用途。
【專利摘要】本發明公開了一種孔鰩魚肉蛋白抗氧化多肽及其制備方法和用途，該抗氧化多肽的氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp-Asp，ESI/MS檢測分子量為1236.38？Da。該抗氧化多肽的制備方法包括組織絞碎、酶解、超濾和層析等步驟。制備得到的高活性多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp-Asp可有效清除羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基，可用作抗氧化相關的藥品或保健食品。<b><u /></b>
【IPC分類】C07K1-20, C07K1-34, C12P21-06, A61P39-06, A23L1-305, C07K7-06, A61K38-08, C07K1-18, C07K1-36
【公開號】CN104558115
【申請號】CN201410831842
【發明人】潘欣, 王斌, 遲長鳳, 陳蔭
【申請人】浙江海洋學院
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月29日