一種具有ace抑制活性的花粉多肽化合物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及多肽LLICGGSAYPR制備抑制血管緊張素轉換酶(ACE)及降血壓中的應 用。
【背景技術】
[0002] 高血壓藥物研究的一個祀點是抑制血管緊張素轉化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE)，ACE是存在于血管內皮細胞、上皮吸收細胞、神經上皮細胞、雄性生殖細胞中 的一種含鋅的二肽羧酶。在人體腎素一血管緊張素系統（RAS)和激肽酶釋放酶一激肽系 統（KKS)中，血管緊張素轉換酶（ACE)對機體血壓和心血管功能起著重要的調節作用（如圖 1)。在RAS中，ACE是起限速作用，ACE可將不具活性的十肽血管緊張素I轉化為具有強烈收 縮血管作用的八肽血管緊張素II，同時血管緊張素II還能刺激醛固酮的分泌進而促進腎 臟對水、鈉、鉀的重吸收，引起鈉貯量和血容量的增加，使血壓升高。在KKS中，ACE還能催化 與心血管系統具有相互作用的神經肽、腦啡肽和P物質等的降解。血管緊張素轉換酶(ACE) 抑制劑是目前常規應用的六大類降壓藥物之一，ACE抑制劑不僅僅用于治療高血壓，同時已 證實可以防止心力衰竭，減少心肌梗死、腦卒中、糖尿病和腎損害發生的危險。ACE抑制劑 對心血管疾病的防治具有兩個明顯的特征：確切的降壓療效和獨特的心臟及血管保護。ACE 抑制劑可能通過阻止心房的電重構和解剖重構，預防了心房纖顫(房顫，AF)的發生。多肽是 一類重要的ACE抑制劑，天然蛋白質的酶解肽是ACE抑制劑肽的主要來源(文獻2 :LieSel〇t Vercruysse1JohnVanCamp,GuySmagghe,J.Agric.FoodChem2005, 53:8106-8115)。血管 緊張素轉化酶對于機體血壓和心血管功能起著重要的調節作用，因此抑制ACE活性的藥物 在心血管、心力衰竭等疾病的治療中發揮重要作用。多肽類的ACE抑制劑在降血壓的同時 不會引起常見降壓藥物的干咳等副作用。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供多肽LLICGGSAYPR在抑制ACE活性中的應用；多肽 LLICGGSAYPR具有ACE抑制活性，作為高血壓、心臟病和心血管病的保健品和藥物先導化合 物具有良好的應用前景。
[0004] 為實現上述目的，本發明以所述多肽LLICGGSAYPR為抑制ACE活性的有效成份。
[0005] 其具有序列表SEQIDNO:1中氨基酸序列；多肽LLICGGSAYPR為ACE抑制劑的活 性成份，其中可添加藥物學上可接受的載體或輔料。
[0006] 具有抑制ACE活性的多肽化合物LLICGGSAYPR的氨基酸序列為Leu-Leu-IIe-CyS-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Pro-Arg。單鏈線性結構，分子量為993. 2Da，白色粉末狀，易溶于水， 對ACE活性具有很強的抑制作用，IC5tl為43. 3iiM。
[0007] 多肽LLICGGSAYPR具備ACE抑制劑所要求的特征：
[0008]LACE傾向于C末端三肽的每個位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制劑，C末 端為Try，Phe，Tyr和Pro而N端為支鏈氨基酸的肽段具有較強的ACE抑制活性。多肽 LLICGGSAYPR的C末端三肽均為疏水性氨基酸分別為Try、Pro和Arg，N末端為Leu帶支鏈， 因此滿足ACE抑制劑的絕大部分要求。
[0009] 2.肽的疏水性是影響其抑制活性的重要原因，抑制活性高的肽都含有較多的疏水 氨基酸。多肽LLICGGSAYPR的疏水氨基酸有Ala，Leu，Pro,lie，含有較多的疏水氨基酸。 [0010]經ACE抑制活性檢測，多肽LLICGGSAYPR的IC5tl 為 43. 3i!M。
[0011] 本發明與現有技術相比，具有如下有益效果：
[0012] 本發明首次從油菜花粉中獲得并確定了活性化合物的結構，化合物具有較好的抑 制ACE的活性，因此作為治療高血壓、心臟病等心血管疾病藥物和保健品的先導化合物具 有良好的潛力和應用前景。
【附圖說明】
[0013] 圖IACE對血壓的調節作用框圖。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1多肽LLICGGSAYPR的制備
[0015] 20g油菜蜂花粉加入液氮研磨破壁后，加入pH=7. 4、50mMTris-HCl緩沖液150ml, 超聲提取三次(一次：400W，超聲4s，停4s，80個循環）；提取結束后于4°C、25000g離心lh， 取上清液，加入上清液4倍體積的混合溶劑(丙酮：乙醇：乙酸=50:50:0. 1 (體積比））沉淀 過夜；沉淀結束后將所有樣品于4°C、25000g離心30分鐘，棄去上清，取沉淀用丙酮洗滌脫 色，然后于4°C、25000g離心15分鐘，棄去上清，沉淀繼續用丙酮反復洗滌直至上清無色，最 后用體積濃度75%乙醇洗滌沉淀并于4°C、25000g離心10分鐘，棄上清，取沉淀物冷凍干 燥，得凍干蛋白。凍干蛋白用含有8M尿素的pH=7. 4、IOOmMNH4HCO3緩沖液復溶，以酶：蛋 白=1:25 (w/w)比例加入胰蛋白酶，37°C酶解20小時。上述酶解產物經制備色譜分離，色 譜柱為C18 (20X250mm，10iim)，所用的流動相A為質量濃度0. 1%甲酸/水溶液，流動相 B為質量濃度0. 1%的甲酸/乙腈溶液，流速為2mL/min，洗脫過程如下：5%B- 35%B(V/V) - 80%B(V/V)。將在280nm下所檢測到的色譜峰分別收集得到的不同組分冷凍干燥，為乳白色 粉末狀樣品。
[0016] 所得樣品經反相液相色譜-串聯質譜系統（RPLC-MS/MS)分析：將冷凍干燥后的酶 解樣品用體積濃度〇. 1%甲酸溶液配制為〇. 4yg/yL，進樣20yL進行LTQ線性離子阱質譜 (配置納升級電噴霧源)分析。利用Xcalibur軟件（Thermo)進行系統控制和數據收集。實 驗得到的質譜數據結果分別在honeybee,BrassicacampestrisL.蛋白質數據庫（http:// www.uniprot.org/)中進行檢索，技術重復3次，數據庫檢索軟件為SEQUEST。獲得序列為 Leu-Leu-IIe-Cys-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Pro-Arg的多月太。
[0017] 實施例2多肽LLICGGSAYPR的ACE抑制活性檢測
[0018]ACE在37°C、PH8. 3的條件下催化分解血管緊張素I的模擬底物Hippuryl-L-His tidyl-L-Leucine(HHL)產生馬尿酸，該物質在228nm處有特征紫外吸收峰。當加入ACE抑 制物時，ACE對HHL的催化作用受到抑制，馬尿酸的生成量會減少。通過測定加入抑制劑前 后的馬尿酸紫外吸收值可以計算出抑制活性的大小。
[0019] 反應體系：
[0020] 緩沖液為 0? 05M，PH8. 3 硼酸鹽緩沖液；底物為Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine (HHL)，MW429. 47,用上述緩沖液配成 5mM;ACE(angiotensin-convertingenzyme)用上述 緩沖液配成〇.lU/ml。
[0021] ODa(對照組，為不存在抑制劑但存在酶時的吸光值):50ill緩沖液+50ulHHL+50ill 緩沖液于37°C水浴5min，然后加入50iUACE，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl終止 反應，再加入Iml乙酸乙酯萃取產物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離心5min，取0. 8ml上清， 90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為0Da。
[0022] ODb (多肽樣品組，為存在抑制劑和酶時的吸光值）：50ill樣品+50iilHHL+50ill 緩沖液于37°C水浴5min，然后加入50illACE，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl終 止反應，再加入Iml乙酸乙酯萃取產物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離心5min，取0. 8ml上 清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為0Db。
[0023] 0DC(空白組，為不存在抑制劑和酶時的吸光值):50ill緩沖液+50iilHHL+50ill緩 沖液于37°C水浴5min，然后加入50ill緩沖液，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl終 止反應，再加入Iml乙酸乙酯萃取產物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離心5min，取0. 8ml上 清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為0DC。
[0024] ACE抑制率（％)= (ODa-ODb)AODa-ODc)X100%
[0025] 分別用 0? 02325mg/ml，0? 04650mg/ml，0? 06975mg/ml的多肽濃度，按上述方法進 行ACE抑制活性檢測。結果如下表：
[0026]
【主權項】
1. 一種具有ACE抑制活性的花粉多肽化合物，其特征在于：所述多肽為LLICGGSAYPR， 具有序列表SEQ ID N0:1中氨基酸序列；該多肽的氨基酸序列具體為，Leu-Leu-IIe-Cys-G Iy-Gly-Ser-Ala-Tyr-Pro-Arg 0
2. -種權利要求1所述多肽在制備ACE抑制劑或心血管藥物中的應用。
3. 按照權利要求2所述的應用，其特征在于：所述ACE抑制劑及降血壓藥物是以多肽 LLICGGSAYPR為活性成份，其中可添加藥物學上可接受的載體或輔料。
【專利摘要】本發明涉及一種具有抑制血管緊張素轉換酶（angiotensin-converting？enzyme,ACE）活性的花粉多肽化合物LLICGGSAYPR，其氨基酸序列分別為Leu-Leu-IIe-Cys-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Pro-Arg。多肽LLICGGSAYPR具有ACE抑制活性，作為高血壓、心臟病和心血管病的保健品和藥物先導化合物具有良好的應用前景。
【IPC分類】A61K38-08, A61P9-12, C07K7-06, A61P9-00, A61P9-04
【公開號】CN104558111
【申請號】CN201310500924
【發明人】鄒漢法, 靳艷, 郭靜, 白萬鈞
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月21日