一種蘋果花粉管微絲的標記方法
【專利說明】一種蘋果花粉管微絲的標記方法
[0001]
技術領域
[0002]本發明涉及一種蘋果花粉管微絲的標記方法。
【背景技術】
[0003]目前國內外幾乎沒有對蘋果花粉管中微絲進行標記的報道。花粉中微絲標記的技術主要有化學染色方法:將帶有熒光染料的鬼筆環肽進行標記，其次冷凍固定結合顯微注射和利用基因重組技術將綠色熒光蛋白基因轉入活體花粉管中的方法進行觀察，但目前多用化學染色的方法較簡捷、高效。近幾年在裸子植物松科花粉中微絲的研宄相對較多，多采用Rhodamine-Phalloidin進行標記。在被子薔薇科植物中，梨花粉管微絲的標記已有報道，標記過程中沒有進行酶解花粉管壁、Triton去污通透的步驟可能是導致標記效果欠佳的原因。而在蘋果花粉管中微絲標記稍顯空白。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種蘋果花粉管微絲的標記方法。
[0005]為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:一種蘋果花粉管微絲的標記方法，包括以下步驟:
O蘋果花粉培養:將儲存在-20°C的花粉取出回溫，采用液體培養法，稱取花粉10mg，懸浮于1ml培養基中，溫度30 °C，100rpm/min振蕩暗培養，培養基組成為:20%鹿糖+0.015%CaCl2+0.01%H3B03；
2)固定:用含有質量百分含量為4%的多聚甲醛洗步驟I)得到的培養好的蘋果花粉兩次，固定1.5h，同時真空抽氣10-15min，得到固定后花粉，所述4%的多聚甲醛是用pH值為6.9的50mM PIPES緩沖液配置的；
3)酶處理:將步驟2)得到的固定后花粉以50mM的PIPES緩沖液洗滌三次，再將洗滌后的花粉置于含有質量百分含量1%的果膠酶和質量百分含量1%的纖維素酶的50mM PIPES緩沖液中，37 °C培養15-20min，得到酶處理后花粉；
4)將步驟3)得到的酶處理后花粉以50mMPIPES緩沖液洗滌三次后，再置于體積百分含量為1%的Triton X-100溶液中，室溫孵育l_2h，得到孵育花粉；
5)將步驟4)得到的孵育花粉以200nMAlexa Fluor 488 phalloidin標記，標記過程為200nM Alexa Fluor488 phalloidin是以PBS緩沖液稀釋的，pH值為9，置于暗培養環境下培養2h，直接觀察或以4°C過夜后觀察再以甘油封片即可得到標記花粉封片；
6)將步驟5)得到的標記花粉封片利用LeicaTCS SP5激光共聚焦掃描成像系統，FITC，Ar激光，波長488nm，每個樣品取180-200個不同光學切片掃描，再將所有光學切片疊加成像即可。
[0006]本發明的有益效果為:本發明在梨花粉微絲標記的方法基礎之上結合裸子植物花粉管微絲的標記方法進行借鑒與改進，通過固定、酶解，運用FITC-Phalloidin標記，可以得到保存相對完好的蘋果花粉微絲，且具有高效、快速的特點，可以獲得更加清晰、明亮的圖片，填補了蘋果花粉管微絲標記的空白，為薔薇科乃至被子植物花粉管中微絲的標記提供參考，應用價值高。
【附圖說明】
[0007]圖1為本發明提供的一種蘋果花粉管微絲的標記方法中，蘋果花粉微絲的分布狀態圖(bar=25 μ m)。
【具體實施方式】
[0008]試劑來源:
多聚甲醛:批號:20080512，北京拓英坊科技有限公司；
PIPES緩沖液:SIGMA，80635-50G，50mM PIPES稱取7.55925g溶解于雙蒸水中，調片pH為6.9，定容至500ml。西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；
果膠酶:Pectolase Y-23，MFCD00131809，北京北元高科農業發展中心；
纖維素酶:Cellulase R-10，批號201097，105-0004，北京北元高科農業發展中心； Triton X-100:SIGMA, T9284-500ML，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；
Alexa Fluor 488 phalloidin:SIGMA, A12379,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；PBS 緩沖液:10mM PBS:分別稱取 8.0 g NaCl, 0.2g KCl, 2.9 g Na2HPO4.12H20，0.2gKH2PO4，依次按順序溶解于800 ml雙蒸水中，用I N HCl調pH 7.2，然后定容至1000 ml。
[0009]實施例1:
一種蘋果花粉管微絲的標記方法，包括以下步驟:
O蘋果花粉培養:將儲存在-20°C的花粉取出回溫，采用液體培養法，稱取花粉10mg，懸浮于1ml培養基中，溫度30 °C，100rpm/min振蕩暗培養，培養基組成為:20%鹿糖+0.015%CaCl2+0.01%H3B03；
2)固定:用含有質量百分含量為4%多聚甲醛(用pH值為6.9的50mM PIPES緩沖液配置)洗步驟I)得到的培養好的蘋果花粉兩次，固定1.5h，同時真空抽氣10-15min，得到固定后花粉；
3)酶處理:將步驟2)得到的固定后花粉以50mM的PIPES緩沖液洗滌三次，再將洗滌后的花粉置于含有質量百分含量1%的果膠酶和質量百分含量1%的纖維素酶的50mM PIPES緩沖液中，37 °C培養15-20min，得到酶處理后花粉；
4)將步驟3)得到的酶處理后花粉以50mMPIPES緩沖液洗滌三次后，再置于體積百分含量為1%的Triton X-100溶液中，室溫孵育l_2h，得到孵育花粉；
5)將步驟4)得到的孵育花粉以200nMAlexa Fluor 488 phalloidin標記，標記過程為200nM Alexa Fluor488 phalloidin是以PBS緩沖液稀釋的，pH值為9，置于暗培養環境下培養2h，直接觀察或以4°C過夜后觀察再以甘油封片即可得到標記花粉封片；
6)將步驟5)得到的標記花粉封片利用LeicaTCS SP5激光共聚焦掃描成像系統，FITC，Ar激光，波長488nm，每個樣品取180-200個不同光學切片掃描，再將所有光學切片疊加成像即可。
[0010]蘋果花粉微絲分布狀態(bar=25 μ??)如圖1所示。
[0011]本發明提供的一種蘋果花粉管微絲的標記方法與現有技術相比，具有以下效果: 1、在梨花粉培養基礎上改進，固定液直接采用4%多聚甲醛固定，而非分別用2%和4%
的多聚甲醛，節省時間用于酶解細胞壁，1%纖維素酶與1%果膠酶的配比使細胞壁酶解且不影響花粉中微絲的形態，運用1%非離子型去污劑Triton X-100，增加膜的通透性，使染料更容易進入胞內標記微絲，圖片中微絲更加清楚，而且保持了微絲的完整性。
[0012]2、在染料的應用上沒有采用裸子植物TRITC標記的鬼筆環肽，采用適宜濃度200nM的FITC標記的鬼筆環肽，TRITC標記的花粉細胞外壁存在時，外壁自發熒光較強，影響標記效果，選用可能與外壁激發光波長較遠的FITC-ph標記，微絲的標記不會受到沒有充分酶解的細胞壁自發熒光影響，可以觀察到更加清晰的微絲形態。
[0013]最后應說明的是:以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種蘋果花粉管微絲的標記方法，其特征在于，包括以下步驟: O蘋果花粉培養:將儲存在-20°C的花粉取出回溫，采用液體培養法，稱取花粉10mg，懸浮于1ml培養基中，溫度30 °C，100rpm/min振蕩暗培養，培養基組成為:20%鹿糖.+0.015%CaCl2+0.01%H3B03； 2)固定:用含有質量百分含量為4%的多聚甲醛洗步驟I)得到的培養好的蘋果花粉兩次，固定1.5h，同時真空抽氣10-15min，得到固定后花粉，所述4%的多聚甲醛是用pH值為.6.9的50mM PIPES緩沖液配置的； 3)酶處理:將步驟2)得到的固定后花粉以50mM的PIPES緩沖液洗滌三次，再將洗滌后的花粉置于含有質量百分含量1%的果膠酶和質量百分含量1%的纖維素酶的50mM PIPES緩沖液中，37 °C培養15-20min，得到酶處理后花粉； 4)將步驟3)得到的酶處理后花粉以50mMPIPES緩沖液洗滌三次后，再置于體積百分含量為1%的Triton X-100溶液中，室溫孵育l_2h，得到孵育花粉； 5)將步驟4)得到的孵育花粉以200nMAlexa Fluor 488 phalloidin標記，標記過程為200nM Alexa Fluor488 phalloidin是以PBS緩沖液稀釋的，pH值為9，置于暗培養環境下培養2h，直接觀察或以4°C過夜后觀察再以甘油封片即可得到標記花粉封片； 6)將步驟5)得到的標記花粉封片利用LeicaTCS SP5激光共聚焦掃描成像系統，FITC，Ar激光，波長488nm，每個樣品取180-200個不同光學切片掃描，再將所有光學切片疊加成像即可。
【專利摘要】本發明公開了一種蘋果花粉管微絲的標記方法，是將蘋果花粉經過培養、固定、酶處理、表面活性劑處理和染料標記步驟后封片進行掃描成像。本發明的有益效果為：本發明在梨花粉微絲標記的方法基礎之上結合裸子植物花粉管微絲的標記方法進行借鑒與改進，通過固定、酶解細胞壁、表面活性劑使染料更容易進入胞內，運用FITC-Phalloidin標記，避免了應用TRITC-Phalloidin由于酶解不充分導致細胞外壁自發熒光的干擾，可以得到保存相對完好的蘋果花粉微絲，且具有高效、快速的特點，可以獲得更加清晰、明亮的圖片，填補了蘋果花粉管微絲標記的空白，為薔薇科乃至被子植物花粉管中微絲的標記提供參考，應用價值高。
【IPC分類】C12Q1-00
【公開號】CN104531824
【申請號】CN201410774514
【發明人】房克鳳, 秦嶺, 曹慶芹, 郝敬虹, 楊瑞, 王建立, 張卿, 楊柳
【申請人】北京農學院
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月16日