一種rab7a和egfp基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及到RAB7A基因和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋 白慢病毒載體的構建，具體涉及一種RAB7A基因和EGFP過表達融合綠色熒光蛋白慢病毒載 體及其構建和在細胞自噬和內吞過程中功能研究。
【背景技術】
[0002] Rab家族是一類RAS相關的EGTP結合蛋白，對囊泡轉運的調節有重要作用。Rab 蛋白作為囊泡運輸的分子開關，其功能是與上游調控子和下游特定的效應子相互作用，并 與GTP的結合和水解過程相偶聯，在囊泡的形成、轉運、錨定、融合等過程中起重要作用。
[0003]Rab7 屬Rab蛋白家族（Ras-likprotininratbrain,Rab)，具有介導晚期胞內 體與溶酶體的膜融合，參與晚期蛋白轉運到溶酶體過程的特定生物學功能，Rab7通過促進 溶酶體的運輸還可以清除胞內病毒，Rab7除了調控內吞過程的晚期運輸外，還參與了受體 的轉運，如將血管緊張素6受體1A，表皮生長因子受體轉運到溶酶體降解，受體所在的位 置決定著信號輸出的結果。因此，推測Rab7可能在信號轉導過程中發揮重要作用。
[0004]Rab蛋白通過與上游調控子和下游特定的效應子相互作用，它們能夠在GTP結合 的活性形式和GDP結合的非活性形式之間轉換，從而調控囊泡轉運的各個環節，如囊泡的 形成、運動、錨著以及融合過程。Rab蛋白的突變或表達異常會引起囊泡運輸異常，導致一些 疾病的產生。近年來，越來越多的研究表明，Rab蛋白參與了囊泡運輸和釋放及天然免疫應 答，還廣泛參與了信號轉導的過程。另有研究表明，Rab蛋白參與的調控囊泡轉運與其參與 的信號轉導存在著必然的聯系，Rab蛋白的定位與它們的功能密切相關。作為定位在晚期內 體或者溶酶體的Rab7,它的功能與內吞體的晚期運輸密切相關，盡管許多實驗目前都支持 Rab7參與了晚期內吞過程，但其中的詳細機制還不清楚。目前，Rab7的效應分子中研究的 比較透徹的是Rab7相關溶酶體蛋白（Rab7_intractinglysosomalprotin，RILP)。主要存 在于細胞內晚期內體/溶酶體結構。Rab7除了在內吞過程晚期的蛋白轉運發揮作用外，還 與信號轉導、細胞凋亡以及抗原遞呈等生理過程高度相關。Rab7本身的基因突變可引起遺 傳性疾病。另外，Rab7與病原體逃逸、腫瘤發生、脂質累積癥高度相關。因此，研究Rab7的 結構及其功能。闡明其在胞內發揮作用的機理，不僅有助于揭示疾病發生的機制，而且可能 為感染性疾病、腫瘤等疾病的治療提供科學依據。
[0005] 慢病毒是一種分子生物學中對基因功能研究常見的工具質粒，能高效轉染原核以 及真核細胞，使細胞能夠合成并且表達目的基因，通過對比目的基因在細胞內表達與否或 者表達強度，實現對目的基因在細胞甚至機體功能中的作用進行驗證和分析。因此，慢病毒 在研究基因在細胞及機體功能中的應用極為廣泛。由于Rab7存在于自噬體和晚內吞體膜 上，是自噬體和內吞體成熟所必需的共享分子之一，能導引胞內貨物沿微管運輸，最后參與 自噬體和內吞體與溶酶體的融合過程，目前認為該分子是調控自噬和內吞的關鍵分子。因 此如何直觀、有效地觀察RAB7A基因的表達及其在細胞自噬與內吞的變化顯得極為重要。
【發明內容】
[0006] 發明目的：在現有技術條件下，本發明第一個目的在于解決RAB7A基因研究中所 需要的過表達載體，并提供EGFP基因和RAB7A基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載 體；本發明的第二個目的在于提供EGFP和RAB7A基因過表達慢病毒載體構建方法，能通過 EGFP的綠色熒光蛋白來示蹤RAB7A蛋白的定位及表達；本發明的第三個目的在于提供這種 過表達載體的應用范例。本發明構建的EGFP和RAB7A基因過表達的融合綠色熒光慢病毒 載體，解決了RAB7A基因研究中過表達載體高效和直觀等問題，該載體以CMV為啟動子，能 夠保證真核基因高效表達，采用EGFP為標記物，能夠通過直觀觀察表達熒光的強弱來判斷 細胞發生自噬和內吞的程度以及RAB7A基因在細胞缺氧過程中的作用，為研究RAB7A基因 的功能提供了良好的工具，為后續的RAB7A的相關研究提供基礎。在本發明中，RAB7A基因 和EGFP基因過表達融合綠色熒光慢病毒載體被轉入HK-2細胞（腎小管上皮細胞）和293T 細胞。通過RAB7A和EGFP的位置以及熒光程度反映在HK-2細胞自噬和內吞的程度。
[0007] 技術方案：為實現上述發明的目的，本發明采用的技術方案是：一種RAB7A和EGFP 基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體，把EGFP基因和RAB7A基因通過搭橋PCR的方 法，在EGFP基因和RAB7A基因之間用一段核苷酸序列連接得到EGFP基因片段+ -段核苷 酸序列+RAB7A基因片段，再以慢病毒載體LV11為骨架載體，在LV11的骨架載體中CMV啟 動子后面按照5'到3'方向插入EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段即得。 RAB7A基因在細胞發生自噬和內吞過程中發揮重要作用，觀察其表達水平可判斷細胞發生 自噬和內吞的程度。
[0008] 上述的一段核苷酸序列如SEQIDN0 :1 所示。SEQIDNO:1 :TCCGGACTCAGATCT。 上述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體的構建方法，包括如 下步驟：在EGFP基因的5'端設計含有限制性內切酶酶切位點的引物，在RAB7A基因3'端 引入限制性內切酶酶切位點引物，用兩對引物擴增EGFP基因和RAB7A基因，再用EGFP基因 的5'端設計含有限制性內切酶酶切位點的引物和在RAB7A基因3'端引入限制性內切酶酶 切位點引物，用搭橋PCR方法得到EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，PCR 反應完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基 因片段，最后EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段克隆到載體LV11中即得。 [0009] 具體構建步驟如下：
[0010] 1)提取人的腎小管上皮細胞（HK-2)總的RNA，以逆轉錄的CDNA為模板，PCR擴增 RAB7A基因片段，所用引物：RAB7F:ATGACCTCTAGGAAGAAAG;RAB7R:TCAGCAACTGCAGCTITCT， 將1. 5 %瓊脂糖凝膠回收得到PCR產物導入PMD18-T載體，測序驗證RAB7A基因的核苷酸順 序；
[0011] 測序結果與NCBI上的人的RAB7A基因序列進行比對。
[0012] 2)以PEGFP-C1的載體為模板擴增EGFP基因，在B1F引物5'端引入BamHI的酶切 位點，擴增EGFP基因。1.5%瓊脂糖凝膠回收，所用引物：
【主權項】
1. 一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體，其特征在于，把 EGFP基因和RAB7A基因融合通過搭橋PCR的方法，在EGFP基因和RAB7A基因之間用一段 核苷酸序列連接得到EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，再以慢病毒載體 LV11為骨架載體，在LV11的骨架載體中CMV啟動子后面按5'到3'方向插入EGFP基因片 段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段即得。
2. 根據權利要求1所述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒 載體，其特征在于，所述一段核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 權利要求1或2所述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病 毒載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：在EGFP基因的5'端設計含有限制性內切 酶酶切位點的引物，在RAB7A基因3'端引入限制性內切酶酶切位點引物，用兩對引物擴增 EGFP基因和RAB7A基因，再用EGFP基因的5'端設計含有限制性內切酶酶切位點的引物 和在RAB7A基因3'端引入限制性內切酶酶切位點引物，用搭橋PCR方法得到EGFP基因片 段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，PCR反應完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收 EGFP基因片段+ -段核苷酸序列+RAB7A基因片段，最后將EGFP基因片段+ -段核苷酸序 列+RAB7A基因片段克隆到載體LV11中即得。
4. 根據權利要求3所述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒 載體的構建方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 提取人的腎小管上皮細胞總的RNA，以逆轉錄的cDNA為模板，PCR擴增RAB7A基因 片段，所用引物：RAB7F: ATGACCTCTAGGAAGAAAG;RAB7R: TCAGCAACTGCAGCITTCT，將 PCR 產 物導入PMD18-T載體，測序驗證RAB7A基因的核苷酸順序； 2) 以PEGFP-C1的載體為模板擴增EGFP基因，在B1F引物5'端引入BamHI的酶切位 點，擴增EGFP基因； 所用引物： BIF ：GATAGGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG B1R ：AGAGGTCATAGATCTGAGTCCGGACTTGTAC； 3) 以RAB7A基因為模板，擴增RAB7基因同時在B2R的引物3'端引入酶切位點EcoRI， 所用引物： B2F ：CTCAGATCTATGACCTCTAGGAAGAAAGTGT ； B2R:GTATGGGATCCTCAGCAACTGCAGCTTTCTGCCGAGGC； 4) 用搭橋PCR的方法擴增EGFP+ TCCGGACTCAGATCT+RAB7A序列，用B1F和B2R引物，以 步驟2)和步驟3)所得到的產物為模板擴增獲得EGFP+ TCCGGACTCAGATCT+RAB7A的兩個基 因連接在一起的序列，所用引物： BIF ：GATAGGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG B2R:GTATGGGATCCTCAGCAACTGCAGCTTTCTGCCGAGGC； 5) 通過BamHI和EcoRI為酶切位點，將EGFP+ TCCGGACTCAGATCT+RAB7A基因的序列連 接到LV11載體上，并通過驗證得到RAB7A和EGFP過表達的融合綠色熒光蛋白的重組質粒。
5. 權利要求1所述的一種RAB7A和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白的慢病毒載體 在研究細胞自噬與內吞以及RAB7A基因功能中的應用。
【專利摘要】本發明提供了一種RAB7A基因和EGFP基因過表達融合綠色熒光蛋白慢病毒載體及其構建方法和應用。本發明載體以慢病毒載體LV11為骨架載體，在LV11載體的CMV啟動子后面按5’到3’方向插入EGFP基因和RAB7A基因片段，本發明構建的EGFP和RAB7A基因過表達的融合綠色熒光蛋白慢病毒載體，解決了RAB7A基因研究中過表達載體有效和直觀等問題。該載體以CMV為啟動子，能夠保證真核基因高效表達；采用EGFP為標記物，能夠通過直觀觀察表達熒光的強弱來判斷細胞發生自噬和內吞的程度以及RAB7A基因在細胞缺氧過程中的作用，為研究RAB7A基因的功能提供了良好的工具，為后續的RAB7A的相關研究提供基礎。
【IPC分類】C12N15-867, C12N15-66, C12Q1-68
【公開號】CN104531762
【申請號】CN201410765155
【發明人】余文敏, 陳平圣, 王智, 丁粉干, 劉靜, 劉蕾
【申請人】東南大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月12日