一種防治Ⅰ型糖尿病和阿爾茨海默癥蛋白藥物的制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生物藥物開發技術領域，具體涉及一種防治I型糖尿病和阿爾茨 海默癥蛋白藥物的制備和應用。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是一種由胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所導致的以血糖高為特征的 代謝性疾病，目前已經成為世界上影響人體健康的重大疾病之一。糖尿病分為I型和II型， 其中，I型糖尿病（胰島素依賴性糖尿病，IDDM)是由于胰島0細胞受到破壞導致胰島素 分泌缺陷的自身免疫性疾病，而II型糖尿病患者體內分泌胰島素的能力并未完全喪失，有 的患者體內胰島素甚至產生過多，但胰島素的作用效果較差，導致體內胰島素相對缺乏。
[0003] I型糖尿病占全國糖尿病總數的5-10%，全國I型糖尿病的患者至少有100萬， 目前還呈上升趨勢。I型糖尿病患者必須長期服用胰島素以維持生命，給家庭和社會帶來 了嚴重的精神壓力和經濟負擔，且糖尿病引起的各種并發癥是導致殘疾和死亡的主要原 因，因此糖尿病的防治迫在眉睫。現有技術中治療糖尿病的藥物多數針對II型糖尿病，用于 治療I型糖尿病的藥物則相對較少。
[0004]I型糖尿病的抗原包括胰島素及其前體、谷氨酸脫羧酶（Glutnmicacid decarnoxylase，GAD)蛋白、熱休克蛋白、羧基肽酶H等多種抗原。研宄表明，僅 給動物口服一種自身抗原如胰島素，就能誘導免疫耐受，對機體產生保護作用 (Science, 1994, 265:1237)。這是由于口服抗原能夠誘導調節性T細胞分泌抑制性細胞因 子IL-4、IL-10和TGF-0，降低自身免疫疾病病灶由IL-2、IFN-y和TNF-a導致的炎癥反 應。這種由相互間無關的各種抗原誘導的，在同一特定器官發生的所有病理免疫反應進行 抑制，被稱為抗原驅動旁觀者抑制（Antigen-drivenBystanderSupression)。抗原驅動旁 觀者抑制的誘導是抗原特異性的，而效應是非特異性的，這為防預I型糖尿病等自身免疫 性疾病提供了一條新途徑（ImmunolToday, 1998, 19:173)。
[0005] 阿爾茨海默癥（Alzheimer'sdisease,AD)俗稱老年癡呆癥，是一種起病隱匿的進 行性發展的神經系統退行性疾病。臨床上主要表現為中樞神經系統的全面衰退，認知功能， 記憶逐漸喪失，造成生活自理能力的障礙和精神行為的異常，最終導致死亡。目前中國阿爾 茨海默癥患者1000萬人之多，而且平均每7秒就會有一名患者加入這個行列。阿爾茨海默 癥患者需要長期護理，全球護理費用超6000億美元，占全球⑶P的1%。隨著我國人口老 齡化問題的突出，對阿爾茨海默癥的預防和治療已顯得越來越重要。AD最顯著的神經病理 組織學特征：老年斑的形成，神經元纖維纏結和神經細胞的大量凋亡。其中老年斑主要是由 41-43個氨基酸片段的0淀粉樣蛋白沉積而形成，Af3是0淀粉樣前體蛋白經由0和Y 分泌酶分解產生的，具有高度的成纖維性和神經毒性。以A0 42及其亞單位片段為靶點的 免疫治療已在臨床試驗中取得顯著效果（Janusetal，2000)。2000年，美國生物制藥企業 Elan制藥公司著手的阿爾茨海默癥疫苗在臨床試驗中，患者的認知和記憶能力得到顯著的 改善。但是，在II期臨床最終因為參與試驗的患者中有幾位患者出現了嚴重的腦膜炎而被 停止。有證據表明，口服疫苗不會引起小鼠腦發炎或出血，大大減少了毒副作用。
[0006] 同時，研宄表明霍亂病毒B亞基（CTB)可作為誘導口服耐受的強大粘膜運載系統， 并且CTB偶聯抗原可能涉及到與傳統大量口服自身抗原產生免疫耐受效應明顯不同的免 疫調節機制，可能涉及到發炎細胞的移動行為的變化（NatBiotechnol，1998, 16, 292)，暗 示CTB偶聯自身抗原不僅使應用口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疾病更具實際應 用價值，而且還有潛在的治療前景（ProcNatlAcadSciUSA，1997, 94:4610)。
[0007] 目前還未見CTB與A0 42的融合蛋白的在I型糖尿病的防治方面的相關報道。
【發明內容】
[0008] 本發明提供了一種融合基因，該融合基因表達的融合蛋白可用于制備I型糖尿病 和阿爾茨海默癥防治藥物。
[0009] 一種融合基因及其表達的融合蛋白，所述融合基因由CTB基因和A0 42基因重組 而成，所述融合蛋白由CTB和A42融合而成。
[0010] 為保證Af3 42基因的表達量，作為優選，所述融合基因中，Af3 42基因的拷貝數為 2;即融合基因CTB-(A0 42)2是由CTB基因和兩倍的A0 42基因重組而成。
[0011] 作為優選，所述融合基因的堿基序列如SEQIDNo.1所示；如SEQIDNo.1所示融 合基因的制備方法為：
[0012] (a)以pBac-CTB-A|3 42質粒為模板，以aF/aR為引物進行擴增，獲得目的片段 CTB-A0 42-GPGP；
[0013] 上游引物aF的堿基序列如SEQIDNo. 3所示，下游引物aR的堿基序列如SEQID No. 4所示；
[0014] (b)以pBac-CTB-Af3 42質粒為模板，以bF/bR為引物進行擴增，獲得目的片段 GPGP-A0 42；
[0015] 上游引物bF的堿基序列如SEQIDNo.5所示，下游引物bR的堿基序列如SEQID No. 6所示；
[0016] (c)以CTB-A0 42-GPGP和GPGP-A0 42互為引物和模板進行鏈延伸反應，獲得產物 S1，以S1為模板，以aF/bR為引物進行擴增，獲得融合基因CTB-(Af3 42)2。
[0017] 由SEQIDNo.1所示的融合基因表達的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所 不〇
[0018] 本發明還提供了含有所述融合基因的表達載體和轉化子。作為優選，所述轉化子 為重組家蠶桿狀病毒。該重組家蠶桿狀病毒的制備方法為：
[0019] ⑴用BamH1和Xhol對融合基因CTB-(Af3 42)2進行雙酶切，將酶切片段連接到 經同樣處理的轉移載體上，構建含目的基因的家蠶桿狀病毒轉移質粒；所述轉移載體可選 用pFastBacl;
[0020] (ii)將家蠶桿狀病毒轉移質粒轉化大腸桿菌，通過藍白斑篩選獲得重組病毒質 粒；
[0021] (iii)將重組病毒質粒轉染家蠶卵巢細胞，獲得重組家蠶桿狀病毒。
[0022] 本發明還提供了一種所述融合蛋白的制備方法，包括：
[0023] (1)將上述制備的重組家蠶桿狀病毒感染家蠶卵巢細胞，進行病毒擴增；
[0024] (2)將擴增得到的重組家蠶桿狀病毒注射至家蠶幼蟲或蠶蛹體內，經5-6d后取蠶 幼蟲或蠶蛹淋巴血，離心取上清，分離純化獲得所述融合蛋白。
[0025] 利用被重組家蠶桿狀病毒感染的家蠶幼蟲或蠶蛹高效表達融合蛋白，比直接用原 核生物表達的活性高，比通過轉基因植物表達的產率高；家蠶是可以無菌大規模飼養經濟 昆蟲，可以低成本、大規模飼養，而且不會造成公害；蠶體中有多重天然蛋白質保護劑，對表 達產物有保護作用，使基因表達產物更加穩定。
[0026] 本發明還提供了所述融合蛋白在制備I型糖尿病治療藥物中的應用。試驗表明， 該融合蛋白能夠顯著改善受試小鼠的胰島炎患病狀況，在連續監測25周后，陰性對照組有 86. 7%小鼠患病，而飼喂融合蛋白的小鼠只有53. 3%患病。
[0027] 本發明還提供了所述融合蛋白在制備阿爾茨海默癥防治藥物中的應用。試驗表 明，該融合蛋白能夠顯著提高阿爾茨海默癥模型小鼠A0 42抗體水平，降低大腦內A0 42的 含量。
[0028] 由此可見，本發明的融合蛋白可作為活性成分，用以制備I型糖尿病和阿爾茨海 默癥防治藥物。作為優選，所述I型糖尿病防治藥物以及阿爾茨海默癥防治藥物均為口服 藥物，為患者解除注射痛苦和感染威脅。
[0029] 本發明將二倍的人A0 42基因插入CTB基因的下游，構建融合基因及含有融合基 因的重組家蠶桿狀病毒，最后將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶幼蟲或蠶蛹，通過家蠶幼蟲或 蠶蛹高效表達融合蛋白。該融合蛋白中，人A0 42與CTB融合表達，CTB能夠強化A0 42的 免疫原性。
[0030] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0031] 本發明利用CTB基因與兩倍的人Af3 42基因構建融合基因，將該融合基因表達的 融合蛋白飼喂小鼠，不僅能顯著改善受試小鼠的胰島炎患病狀況，在連續監測25周后，陰 性對照組有86. 7%小鼠患病，而飼喂融合蛋白的小鼠只有53. 3%患病；還能顯著提高阿爾 茨海默癥模型小鼠A0 42抗體水平，降低阿爾茨海默癥模型小鼠大腦內A0 42的含量，提示 該融合蛋白能用于制備I型糖尿病和阿爾茨海默癥防治藥物。
【附圖說明】
[0032] 圖1為桿狀病毒轉移質粒pBac-CTB-(A0 42)2的圖譜；
[0033] 圖2為家蠶表達的融合蛋白的Westren雜交分析結果圖；
【具體實施方式】
[0034] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。
[0035] 實施例1、融合基因的構建
[0036] (1)以pBac-CTB-A |3 42質粒為模板，以aF/aR為引物進行擴增，獲得目的片段 CTB-A 0 42-GPGP；
【主權項】
1. 一種融合基因，其特征在于，由CTB基因和A 0 42基因重組而成。
2. 如權利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述A 0 42基因的拷貝數為2。
3. 如權利要求1或2所述的融合基因，其特征在于，堿基序列如SEQ ID No. 1所示。
4. 含有如權利要求1?3任一所述融合基因的表達載體。
5. 含有如權利要求1?3任一所述融合基因的轉化子。
6. 如權利要求5所述的轉化子，其特征在于，所述轉化子為重組家蠶桿狀病毒。
7. 如權利要求1?3任一所述融合基因表達的融合蛋白。
8. 如權利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
9. 如權利要求7或8所述融合蛋白在制備I型糖尿病治療藥物中的應用。
10. 如權利要求7或8所述融合蛋白在制備阿爾茨海默癥防治藥物中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種防治Ⅰ型糖尿病和阿爾茨海默癥蛋白藥物的制備和應用。本發明利用CTB基因與兩倍的人Aβ42基因構建融合基因，將該融合基因表達的融合蛋白飼喂小鼠，不僅能顯著改善受試小鼠的胰島炎患病狀況，在連續監測，25周后，陰性對照組有86.7％小鼠患病，而飼喂融合蛋白的小鼠只有53.3％患病；還能顯著提高阿爾茨海默癥模型小鼠Aβ42抗體水平，降低大腦內Aβ42的含量，提示該融合蛋白能用于制備Ⅰ型糖尿病和阿爾茨海默癥的防治藥物。
【IPC分類】A61K38-17, A61P3-10, C12N15-866, C12N7-01, C12N15-62, C07K19-00, A61P25-28, A61K47-42
【公開號】CN104531736
【申請號】CN201410734935
【發明人】金勇豐, 劉寶平, 楊赟, 岳媛, 潘華偉, 李司
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月5日