一株海洋希瓦氏細菌及其在誘導厚殼貽貝稚貝附著中的應用
【專利說明】一株海洋希瓦氏細菌及其在誘導厚殼貽貝稚貝附著中的應用
技術領域
[0001]本發明涉及一株海洋希瓦氏細菌及其在誘導厚殼貽貝稚貝附著方面的應用，具體涉及一株海洋希瓦氏細菌(Shewanella sp.ECSMB56)的分離、純化、鑒定和保藏以及其在不同初始細菌密度條件下形成的微生物被膜對厚殼貽貝稚貝附著的影響作用。
【背景技術】
[0002]因此，現有技術存在缺陷，需要改進厚殼貽貝(Mytilus coruscus)，隸屬于軟體動物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，貽貝目(Mytilodia)，貽貝科(Mytilidae)，是我國重要的海產貝類養殖品種，分布于黃海、渤海和東海沿岸。在厚殼貽貝生活史中，浮游生活階段的幼蟲成熟后，便會附著變態成為稚貝，并最終發育為成貝。在由稚貝向成貝生長發育的過程中，當環境發生變化時，厚殼貽貝稚貝能夠自行切斷足絲，開始爬行并重新選擇適宜的附著基進行再次附著。另外，厚殼貽貝具有生長快、抗病能力和環境適應能力強等特點，但由于自然資源的大量采捕和人工培育技術的不足，制約了厚殼貽貝養殖產業的發展。因此，探索利用細菌形成微生物被膜誘導厚殼貽貝附著技術等生物工程技術顯得尤為必要。
【發明內容】
[0003]本發明涉及的海洋希瓦氏細菌(Shewanella sp.ECSMB56)來源于浙江省舟山市枸杞島海域(122° 46' E ；30° 43r N)的自然微生物被膜。利用ZoBell 2216E固體培養基分離、純化得到純種菌落，并通過16S rRNA基因測序與GENEBAN(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中核酸數據進行比對后上傳至NCBI數據庫。最終確定菌名為希瓦氏細菌，獲取序列號為KM369861，該細菌菌株ECSMB56保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研宄所，郵編100101，保藏日期為2014年10月20日，保藏編號為CGMCC No:9798，分類命名:希瓦氏菌Shewanella sp.
[0004]實驗證實，本發明成功分離、純化和鑒定的海洋希瓦氏細菌菌株ECSMB56形成的微生物被膜對厚殼貽貝稚貝附著具有誘導作用。
【附圖說明】
[0005]圖1不同初始細菌密度形成的微生物被膜對厚殼貽貝稚貝附著的誘導作用；
【具體實施方式】
[0006]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0007]菌株的分離及保藏:
[0008]本發明涉及的海洋希瓦氏細菌(Shewanella sp.ECSMB56)來源于浙江省舟山市枸杞島海域(122° 46' E ；30° 43r N)的自然微生物被膜。利用ZoBell 2216E固體培養基分離、純化得到純種菌落，并通過16S rRNA基因測序與GENEBAN(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中核酸數據進行比對后上傳至NCBI數據庫。最終確定菌名為希瓦氏細菌，獲取序列號為KM369861，該細菌菌株ECSMB56保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研宄所，郵編100101，保藏日期為2014年10月20日，保藏編號為CGMCC No:9798，分類命名:希瓦氏菌Shewanella sp.
[0009]本發明涉及的海洋希瓦氏細菌對厚殼貽貝稚貝附著的誘導實驗是將純種菌株先接到ZoBell 2216E液體培養基中擴大培養，離心洗滌并制成懸浮液。然后用吖啶橙染色并在熒光顯微鏡1000倍鏡頭下隨機選取10個點進行計數，確定菌液總密度為3.4X108cells/ml?之后將一枚滅菌的載玻片放在盛有20ml菌液初始細菌密度為1.0X 106cells/ml、3.0X 106cells/ml、6.0X 106cells/ml 和 10X 106cells/ml 的培養皿中，在18°C、黑暗條件下培養48h形成微生物被膜。最后將一枚附有微生物被膜的載玻片及10只厚殼貽貝稚貝(殼長1.22±0.05mm ;殼高0.75±0.02mm)放入含有滅菌過濾海水的培養皿中，在12h時記錄稚貝的附著率，即載玻片上附著的稚貝個數占該培養皿中稚貝總個數的百分比。
[0010]研宄發現該細菌形成的微生物被膜對厚殼貽貝稚貝的附著有較高的誘導活性，實驗結果如圖1所示，在初始密度為10X106cells/ml時(當初始細菌密度大于10X106cells/ml時，附著率基本保持不變)，形成的微生物被膜對稚貝附著的誘導率高達55%，相比與無微生物被膜的對照組提高了 45%。另外，不同初始密度條件下形成的微生物被膜對稚貝的誘導活性也有所不同，初始密度為1.0X 106cellS/ml時形成的微生物被膜對稚貝的誘導活性僅為37%。由此可得，該株海洋希瓦氏細菌形成的微生物被膜能夠有效誘導海產貝類厚殼貽貝稚貝的附著，本研宄成果對于闡明厚殼貽貝稚貝附著機制和厚殼貽貝培育與養殖均具有重要的意義。
[0011]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
【主權項】
1.一株海洋希瓦氏細菌，保藏編號為CGMCC No:9798，分類命名:希瓦氏菌Shewanellasp.ο
2.根據權利要求1所述的海洋希瓦氏細菌在誘導厚殼貽貝稚貝附著中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，將純種菌株先接種到ZoBell2216E液體培養基中擴大培養，離心洗滌并制成懸浮液，制得海洋希瓦氏細菌菌液初始細菌密度為1-10 X 106cells/ml。
【專利摘要】本發明公開了一株海洋希瓦氏細菌及其在誘導厚殼貽貝稚貝附著中的應用，保藏編號為CGMCC No：9798，分類命名：希瓦氏菌Shewanella sp。實驗證實，本發明成功分離、純化和鑒定的海洋希瓦氏細菌菌株ECSMB56形成的微生物被膜對厚殼貽貝稚貝附著具有誘導作用。CGMCC No:979820141020
【IPC分類】C12R1-01, A01K61-00, C12N1-20
【公開號】CN104531560
【申請號】CN201410741373
【發明人】楊金龍, 郭行磐, 陳芋如, 梁簫
【申請人】上海海洋大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月9日