一種從豬肺中提取肝素的生產方法

一種從豬肺中提取肝素的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種從豬肺中提取肝素的生產方法。
【背景技術】
[0002]肝素，是酸性粘多糖硫酸酯類抗凝血藥。近年來研宄證明肝素還有降血脂作用，多年來，國際市場對肝素的需求一直十分旺盛。因肝素是從動物內臟中提取加工而得的，產量受到一定限制，時常滿足不了市場需求。自20世紀90年代后期開始，全球市場肝素需求大幅增加，我國肝素生產和出口連年均以較大幅度上升，出口量和出口金額呈快速增長態勢。中國已成為世界上首屈一指的肝素原料藥出口大國。2001年，全國肝素產品出口金額為4460萬美元。2002年，出口金額達5894萬美元，比上年增長了 32.17 %。肝素產品在我國醫藥類產品出口金額排序中已躋身前5位，僅次于維生素C、檸檬酸、維生素E和磺胺。
[0003]我國生產的肝素產品除滿足國內市場外，還大量出口。長期以來，我國產品出口順暢，只要質量達到要求，常常有多少就出口多少。與之形成對比的是，由于我國的經濟發展狀況和人民生活水平的限制，，對這種昂貴(注射用精品8?10美元/mega，口服用為7?8美元/mega)的抗凝血藥目前國內消費量極小，主要是創匯，銷往日本、美國、歐洲等發達國家和地區。
[0004]目前，國內生產肝素的方法，主要是鹽解法和酸解法，比如公開號為CN101735340A、CN101649008A、CN101519459A等等的中國發明申請，這兩種方法都是采用豬小腸粘膜為原料，在堿性條件下通過鹽解、酶解，出去部分蛋白質后，通過三甲胺季銨性強堿性陽離子交換樹脂吸附劑洗脫，在洗脫液中加以乙醇沉淀既得肝素鈉初級原料出售，其缺點是生產周期長達48h，反應溫度為95-100°C，能源消耗大，水解不完全，收率低，生產I億國際單位(IU)肝素粗品需2800-3000根豬小腸粘膜，所得產品純度低，粗品含肝素至多為80效價/毫克；并產生大量的肥腸渣和廢水，污染環境；且生產過程中樹脂再生困難，這種制備方法由于生產周期長，水解不完全、不徹底，制得的肝素鈉純度低、收率低、效價低，很難進行規模性生產，且不能滿足市場的大量需求。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種產品生產周期短、純度高、效價高、雜質少、綠色環保的利用豬肺提取肝素粗品的生產方法，本工藝采用生物酶解法從原材料易得的豬肺中提取肝素粗品。
[0006]本發明實現目的的技術方案如下:
一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(1)預處理:將豬肺清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入水攪拌得到豬肺混合液，其中豬肺和水的質量比為1:3-4 ；(2)酶解:調豬肺混合液pH值為6.5?8.0，加入豬肺重量的1.5%?2.5%的硫酸軟骨素復合酶，攪拌均勻，升溫至30?45°C，保溫反應30?60min后，保持反應液的pH值為7.0?7.5，加入豬肺重量的0.25%?0.5%胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫2?4h，繼續升溫到90?100°C，保持5?lOmin，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，調濾液pH值為8.5?10.5，攪拌升溫到55?65°C時加入豬肺重量的0.1%?0.4%的澄清劑，繼續升溫至90?95°C，保溫反應2?4h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2?0.4 μπι濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為10?30g/kg，常溫反應8?12h過濾，得濾液，將濾液調pH至4.5?5.5，加入等體積的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；
[6]冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度-20?10°C，真空度0.05?0.08Mpa，干燥時間2?4h。
[0007]所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(2)硫酸軟骨素復合酶為硫酸軟骨素酶A、B和C中二種或以上的組合。
[0008]所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(3)澄清劑為天然1+1澄清劑，使用之前用冰醋酸配成1%的溶液。
[0009]所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(5)調pH值所用的酸為冰醋酸、草酸、檸檬酸中的一種或者二種混合。
[0010]本發明的優點和有益效果為:1、本發明采用的酶解方法能更徹底全面地溶解豬肺漿液，用胰蛋白酶終止酶解，真空冷凍干燥技術穩定了產品的質量以及提高收率，同時獲得的粗品雜質少、效價高；2、本發明生產方法中采用澄清劑來替代乙醇反復醇沉來去除蛋白質的傳統工藝，具有去除率高，節約了大量乙醇的使用量，降低了生產成本；3、本發明工藝設計合理，生產無毒、無害、生物綠色環保，豬肺原料來源易得，運營生產成本低，適合大規模工業化生產。
【具體實施方式】
[0011]
實施例1:一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(1)預處理:將豬肺5kg清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入15kg水攪拌得到豬肺混合液；(2)酶解:用氫氧化鈉調豬肺混合液pH值為6.5，加入75g的硫酸軟骨素A和C，攪拌均勻，升溫至30°C，保溫反應30min后，保持反應液的pH值為7.0，加入12.5g胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫2h，繼續升溫到90°C，保持5min，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，用氫氧化鈉調濾液PH值為8.5，攪拌升溫到55°C時加入5g的澄清劑，繼續升溫至90°C，保溫反應2h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2 μπι濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為ΙΟ/kg,常溫反應8h過濾，得濾液，將濾液用冰醋酸調pH至4.5，加入20kg的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度-20°C，真空度0.05Mpa，干燥時間2h，既得肝素粗品20 g，其效價為每毫克100單位。
[0012]實施例2:—種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(1)預處理:將10kg豬肺清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入350kg水攪拌得到豬肺混合液(2)酶解:用氫氧化鈉調豬肺混合液pH值為7.0，加入豬肺重量的2kg的硫酸軟骨素A和B，攪拌均勻，升溫至40°C，保溫反應45min后，保持反應液的pH值為7.0，加入0.3kg胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫3h，繼續升溫到95°C，保持7min，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，用氫氧化鈉調濾液pH值為9.0，攪拌升溫到60°C時加入0.2kg的澄清劑，繼續升溫至93°C，保溫反應3h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2 μ m濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為20g/kg，常溫反應1h過濾，得濾液，將濾液用草酸調pH至5.0，加入350kg無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度-10°C，真空度0.07Mpa，干燥時間3h，既得肝素粗品0.5kg,其效價為每毫克90單位。
[0013]實施例3:—種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(1)預處理:將100kg豬肺清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入4000kg水攪拌得到豬肺混合液(2)酶解:調豬肺混合液pH值為8.0，加入豬肺重量的25kg的硫酸軟骨素B和C，攪拌均勻，升溫至45°C，保溫反應60min后，保持反應液的pH值為7.5，加入5kg胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫4h，繼續升溫到100°C，保持lOmin，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，用氫氧化鈉調濾液pH值為10.5，攪拌升溫到65°C時加入4kg的澄清劑，繼續升溫至95°C，保溫反應4h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.4 μ m濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為30g/kg，常溫反應12h過濾，得濾液，將濾液用檸檬酸調pH至5.5，加入4000kg的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度0°c，真空度0.0SMpa,干燥時間4h，既得肝素粗品4.8kg，其效價為每毫克100單位。
【主權項】
1.一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(I)預處理:將豬肺清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入水攪拌得到豬肺混合液，其中豬肺和水的質量比為1:3-4 ；(2)酶解:調豬肺混合液pH值為6.5?8.0，加入豬肺重量的1.5%?2.5%的硫酸軟骨素復合酶，攪拌均勻，升溫至30?45°C，保溫反應30?60min后，保持反應液的pH值為7.0?7.5，加入豬肺重量的0.25%?0.5%胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫2?4h，繼續升溫到90?100°C，保持5?lOmin，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，調濾液pH值為8.5?10.5，攪拌升溫到55?65°C時加入豬肺重量的0.1%?0.4%的澄清劑，繼續升溫至90?95°C，保溫反應2?4h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2?0.4 μπι濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為10?30g/kg，常溫反應8?12h過濾，得濾液，將濾液調pH至4.5?5.5，加入等體積的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度-20?10°C，真空度0.05?0.08Mpa，干燥時間2?4h。
2.根據權利要求1所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(2)硫酸軟骨素復合酶為硫酸軟骨素酶A、B和C中二種或以上的組合。
3.根據權利要求1所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(3)澄清劑為天然1+1澄清劑，使用之前用冰醋酸配成1%的溶液。
4.根據權利要求1所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(5)調pH值所用的酸為冰醋酸、草酸、檸檬酸中的一種或者二種混合。
【專利摘要】一種從豬肺中提取肝素的生產方法，步驟如下：將新鮮豬肺絞碎成漿液、漿液保溫酶解、酶解液過濾收集濾液、對濾液進行除蛋白處理、超濾、氧化沉淀、冷凍干燥得肝素粗品。本發明的優點和有益效果為：1、本發明采用的酶解方法能更徹底全面地溶解豬肺漿液，用胰蛋白酶終止酶解，真空冷凍干燥技術穩定了產品的質量以及提高收率，同時獲得的粗品雜質少、效價高；2、本發明生產方法中采用澄清劑來替代乙醇反復醇沉來去除蛋白質的傳統工藝，具有去除率高，節約了大量乙醇的使用量，降低了生產成本；3、本發明工藝設計合理，生產無毒、無害、生物綠色環保，豬肺原料來源易得，運營生產成本低，適合大規模工業化生產。
【IPC分類】C08B37-10
【公開號】CN104530262
【申請號】CN201510036218
【發明人】郭慶, 徐賓朋, 趙厚發
【申請人】安徽科寶生物工程有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月26日