用于檢測苯二氮卓類藥物的單克隆抗體及酶聯免疫方法與試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物殘留分析和免疫學技術領域，具體涉及一種用于檢測苯二氮卓類 藥物的單克隆抗體，本發明還涉及用于檢測苯二氮卓類藥物的酶聯免疫方法與試劑盒。
【背景技術】
[0002] 苯二氮卓類（Benzodiazepines)是一類作用于中樞神經系統的鎮靜劑，能夠引起 動物鎮靜、嗜睡，或對周圍的環境冷漠等作用。藥物種類很多，多為1，4_苯并二氮卓的衍 生物，其基本結構是由兩個苯環和一個含有7個原子的雜環組成。通常用于將生產食品動 物運往屠宰場過程中，以減少壓力，降低動物的死亡率。此外，由于其使動物嗜睡，起到間接 促進動物生長的作用。因此在利益的驅使下大量或者不遵守休藥期的使用這類藥物會導 致藥物殘留，人長期攝入苯二氮卓類藥物，可產生依賴性或成癮性，突然停藥可產生停藥反 應，表現為抑郁，精神激動，失眠等，由于這類藥物易通過胎盤屏障，會對嬰兒或幼畜會產生 呼吸抑制作用。歐盟未制定此類藥物的最大殘留限量（MRL)，但禁止這類藥物用于所有食 品動物。英國也僅批準用于伴侶動物的治療。我國農業部、衛生部、國家藥品監督管理局于 2002年聯合發布的《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》中明確指出：嚴禁 地西泮（安定）及其鹽、酯及制劑在動物飼料和飲水中添加，允許治療劑量，禁止作為食品 動物的促生長使用，在動物性食品中不得檢出。
[0003] 儀器分析方法的優點在于靈敏、準確、分離度高并且可進行多殘留檢測的定性、定 量研宄，但需要昂貴的儀器、繁瑣的前處理、熟練的專業操作員。免疫分析方法克服了儀器 分析方法的缺陷，尤其是ELI SA方法操作簡單、成本低、靈敏度高、只需要簡單的儀器。現有 的ELISA方法的報道，大多為多克隆抗體的制備，變異性大、穩定性差，或者單殘留檢測。所 以，建立一種能同時檢測多個苯二氮卓類藥物殘留的酶聯免疫方法很有必要。
[0004] CN101315374公開了一種地西泮殘留分析酶聯免疫檢測試劑盒，以3-半琥珀酸酯 地西泮為半抗原，與牛血清白蛋白偶聯得到免疫原，所制備的多克隆抗體僅能特異性識別 地西泮。CN102565409 A公開了一種苯二氮卓類藥物的檢測試劑盒，采用購自美國美迪生物 技術有限公司的抗苯二氮卓單克隆抗體，該抗體能識別奧沙西泮、地西泮、阿普唑侖等多種 苯二氮卓類藥物，但是不能識別去甲西泮、替馬西泮、艾司唑侖。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一個目的是提供一種能同時識別去甲西泮、替馬西泮、艾司唑侖等多 個苯二氮卓類藥物的單克隆抗體。
[0006] 本發明的第二個目的是利用該單克隆抗體，制備一種檢測苯二氮卓類藥物的酶聯 免疫試劑盒。
[0007] 本發明的第三個目的是利用該試劑盒，建立一種用于苯二氮卓類藥物非診斷目的 檢測的酶聯免疫方法。
[0008] 上述目的是通過以下技術方案實現的：
[0009] -種能同時識別多個苯二氮卓類藥物的單克隆抗體，它是由雜交瘤細胞3D7所分 泌的，所述雜交瘤細胞3D7保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO: C201352。
[0010] 所述的苯二氮卓類藥物，指的是地西泮、硝西泮、去甲西泮、替馬西泮、奧沙西泮、 艾司唑侖、阿普唑侖。
[0011] 進一步，本發明提供了一種能同時檢測肉類產品中多個苯二氮卓類藥物殘留的酶 聯免疫方法，該方法包括包被原、抗體的制備以及樣品前處理和檢測等步驟，具體如下：
[0012] (1)將半抗原7-氨基硝西泮通過碳二亞胺（EDC)法與卵清蛋白（OVA)偶聯得到包 被原；
[0013] (2)用保藏號為CCTCC NO:201352的雜交瘤細胞3D7制備單克隆抗體；
[0014] (3)用步驟⑴的包被原包被固相載體；
[0015] (4)將待測樣品提取后進行酶聯免疫檢測。
[0016] 進一步優選地，所述待測樣品的提取方法是：將待測樣品先用0. IM NaOH提取，再 加入乙酸乙酯離心，取乙酸乙酯層，氮氣吹干，用PBS緩沖液復溶后加入正己烷去脂，取下 清液。
[0017] 本發明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規的其它試劑組合，制成了 能檢測苯二氮卓類藥物的酶聯免疫檢劑盒，結合上述酶聯免疫方法，實現了對苯二氮卓類 藥物的酶聯免疫檢測。
[0018] 本發明的主要優點是：
[0019] 1.本發明以7-氨基硝西泮為半抗原，制備的單克隆抗體能夠識別地西泮、硝西 泮、去甲西泮、替馬西泮、奧沙西泮、艾司唑侖、阿普唑侖，而現有技術無法同時識別以上苯 二氮卓類藥物。
[0020] 2.本發明制備的單克隆抗體對以上苯二氮卓類藥物有較高的識別靈敏度，地西泮 的IC 5tl僅為8.88 μ g/L，去甲西泮的IC5tl僅為6.36 μ g/L，硝西泮為17. 94 μ g/L，識別靈敏 度優于現有的苯二氮卓類單克隆抗體。而且對以上幾種苯二氮卓類藥物有較高的交叉反應 率，對其它的苯二氮卓類藥物交叉反應率很低，說明具有較好的特異性。
[0021] 3.本發明建立的ELISA方法和試劑盒能同時檢測肉類產品中地西泮、硝西泮等多 種苯二氮卓類藥物的殘留，方法準確度高，精密度好、檢測效率高，成本低。
[0022] 4.方法中所涉及的樣品前處理方法簡單，快速，所使用的有機溶劑為乙酸乙酯，對 人體及環境危害較小，正己烷去脂能減少干擾，更利于檢測。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明制備的半抗原（7-氨基硝西泮）、牛血清白蛋白（BSA)、免疫原（7-氨 基硝西泮-BSA偶聯物）的紫外掃描圖譜。
[0024] 圖2為本發明制備的半抗原（7-氨基硝西泮）、卵清蛋白（OVA)、包被原（7-氨基 硝西泮-OVA偶聯物）的紫外掃描圖譜。
[0025] 圖3為本發明的單克隆抗體與地西泮標準品的間接競爭ELISA反應曲線，X軸為地 西泮標準溶液濃度對數值，Y軸為地西泮標準品溶液的光密度值除以"零"孔光密度值（B/ B0) 〇
【具體實施方式】
[0026] 下面通過實施例對本發明作進一步說明，但不限制本發明。
[0027] 實施例1免疫原和包被原的制備
[0028] I. 1免疫原的制備
[0029] 稱取硝西泮28mg于圓底燒瓶中，溶于甲醇10mL，加入鈕碳2. 8mg，通入氫氣反應 30mim，濾掉鈀碳，反應液蒸干，即得到半抗原7-氨基硝西泮，加入N，N-二甲基甲酰胺ImL 復溶。
[0030] 稱取牛血清白蛋白（BSA) 70mg溶解于硼酸鹽緩沖液IOml中，將上述半抗原滴加到 載體蛋白中。
[0031] 吸取25%的戊二醛溶液0. 2ml用PBS I. 8ml的稀釋10倍后，緩慢滴加滴加到半抗 原與載體蛋白的混合液中，4°C反應過夜。
【主權項】
1. 一種能識別苯二氮卓類藥物的單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCC N0:C201352的 雜交瘤細胞3D7所分泌的，所述苯二氮卓類藥物為地西泮、硝西泮、去甲西泮、替馬西泮、奧 沙西泮、艾司唑侖、阿普唑侖。
2. 權利要求1中所述的雜交瘤細胞3D7,保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為 CCTCC N0:C201352。
3. 權利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測苯二氮卓類藥物的酶聯免疫試劑盒中的 應用。
4. 包含權利要求1所述單克隆抗體的試劑盒。
5. 根據權利要求4所述的試劑盒，該試劑盒是檢測地西泮、硝西泮、去甲西泮、替馬西 泮、奧沙西泮、艾司唑侖、阿普唑侖的酶聯免疫試劑盒。
6. 權利要求4或5所述的試劑盒在地西泮、硝西泮、去甲西泮、替馬西泮、奧沙西泮、艾 司唑侖、阿普唑侖非診斷目的檢測中的應用。
7. -種檢測肉類產品中地西泮、硝西泮、去甲西泮、替馬西泮、奧沙西泮、艾司唑侖、阿 普唑侖藥物殘留的酶聯免疫方法，包括以下步驟： (1) 將7-氨基硝西泮與卵清蛋白偶聯得到包被原； (2) 用保藏號為CCTCC NO:201352的雜交瘤細胞3D7制備單克隆抗體； (3) 用步驟（1)的包被原包被固相載體； (4) 將待測樣品提取后進行酶聯免疫檢測。
8. 根據權利要求7所述的檢測肉類產品中地西泮、硝西泮、去甲西泮、替馬西泮、奧沙 西泮、艾司唑侖、阿普唑侖藥物殘留的酶聯免疫方法，其特征在于：所述待測樣品的提取方 法是：將待測樣品先用0. 1M NaOH提取，再加入乙酸乙醋尚心，取乙酸乙醋層，氣氣吹干，用 PBS緩沖液復溶后加入正己烷去脂，取下清液。
【專利摘要】本發明公開了一種能識別地西泮、硝西泮等苯二氮卓類藥物的特異性單克隆抗體和一種用于檢測地西泮、硝西泮等苯二氮卓類藥物的酶聯免疫方法及試劑盒。本發明的單克隆抗體是由保藏號為CCTCC NO:201352的雜交瘤細胞3D7所分泌的。與現有技術相比，本發明制備的單克隆抗體可同時識別地西泮、硝西泮等多種苯二氮卓類藥物。本發明的酶聯免疫方法及試劑盒具有檢測效率和靈敏度高，精密度和準確度好等優點。CCTCC NO:C20135220130416
【IPC分類】G01N33-577, C12N5-20, C07K16-44, C12R1-91
【公開號】CN104530240
【申請號】CN201410829641
【發明人】袁宗輝, 彭大鵬, 王涓, 潘源虎, 王玉蓮, 馮亮, 劉振利
【申請人】華中農業大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月26日