作為可溶性,生物可降解基因送遞載體的聚-l-賴氨酸的聚酯類似物的制作方法

            文檔序號:3689039閱讀:230來源:國知局

            專利名稱::作為可溶性,生物可降解基因送遞載體的聚-l-賴氨酸的聚酯類似物的制作方法發明的背景本發明涉及基因治療和藥物送遞。更具體地說,本發明涉及送遞基因治療應用的核酸或其它非可溶性生物活性分子如蛋白質、肽或小分子非可溶性藥物的組合物及其使用和制造方法。生物可降解聚合物作為藥物送遞系統在不斷受到人們的注意(R.Langer,NewMethodsofDrugdelivery,249Science1527-1533(1990);B.Jeong等人,BiodegradableBlockCopolymersasInjectableDrug-deliverySystems,388Nature860-862(1997))。因為現在一般都認為基因是用于治療許多類型疾病的藥劑,并且如許多臨床試驗所證實的,基因治療也正在被廣泛使用(如參見M.A.Kay等人,GeneTherapy,94Proc.Nat’lAcad.Sci.USA1744-12746(1997);C.Bordignon等人,GeneTherapyinPeripheralBLoodLymphocytesandBoneMarrowforADA-immunodeficientPatients,270Science470-475(1995)),因此迫切需要一種安全而有效的基因載體。由于基因能夠利用宿主細胞所提供的生物合成機制產生生物活性蛋白質,所以它們是治療各種疾病的很有吸引力的用于治療的侯選藥物。基因轉移的主要技術障礙是缺乏理想的基因送遞系統。有許多已建立的將基因轉入細胞內的方法,其中包括磷酸鈣沉淀、電穿孔、顆粒轟擊、脂質體送遞、病毒載體送遞及受體介導的基因送遞(A.V.Kavanov,Self-assemblingComplexesforGenedelivery,P.L.Felgner&L.W.Seymour,.T.Wiley&Sons(1998);P.L.Chang,SomaticGeneTherapy,CRCPress(1995))。已研究了使用逆轉錄病毒或腺病毒載體的轉染方法。特別是已成功地使用逆轉錄病毒將外源基因導入活躍分裂細胞的基因組中,從而得到穩定的轉化體(D.G.Miller等人,GeneTransferbyRetrovirusVectorsOccursOnlyinCellsthatareActivelyReplicatingattheTimeofInfection.10Mol.CellBiol.4239-4242(1990))。在將基因插入“輔助”細胞系以彌補有缺陷的載體的情況下,病毒載體系統常常產生一種轉導感染劑。另外,已知宿主對腺病毒的免疫反應,將它們作為轉移促進劑的應用只限于一次投用。針對這種限制,已利用流感病毒血凝素的融合肽作為內體溶解劑以代替腺病毒,但只取得了有限的成功(S.Gottschalk等人,ANovelDNA-PeptideComplexforEfficientGeneTransferandExpressioninMammalianCells,3GeneTher.448-457(1996))。然而,盡管它們在體外的轉染效率很高,但在體內將基因插入宿主細胞基因組中則依賴于病毒感染途徑。利用病毒感染途徑進行人體基因治療引出了關于內源性病毒重組、致癌作用及炎性或免疫反應的嚴重問題(G.Ross等人,GeneTherapyintheUnitedStates:AFive-YearStatusReport.7Hum.GeneTher.,1781-1790(1996))。由于這些問題,使得病毒載體在人類基因治療方面的應用受到極大限制。與病毒基因載體相比,使用基于非病毒的基因治療有幾方面的優點,其中包括相對安全與生產成本較低。正在廣泛尋求非病毒基因送遞系統如陽離子脂質體或合成的基因載體如聚-L-賴氨酸(PLL)作代用品,并為繞開病毒載體中所遇到的某些問題而進行了深入研究(K.A.Mislick等人,TransfectionofFolate-polylysineDNAComplexes:EvidenceforLysosomalDelivery,6BioconjugateChem.512-515(1995);J.O.Rdler等人,StructureofDNA-cationicLiposomeComplexes:DNAIntercalationinMultilamellarMembranesinDistinctInterhelicalPackingRegimes,275Science810-814(1997);J.Cheng等人,EffectofSizeandSerumProteinsonTransfectionEfficiencyofPoly((2-dimethylamino)ethylmethacrylate)-plasmidnanoparticles,13Pharm.Res.1038-1042(1996))。有幾種聚合物材料目前正在研究用作基因載體,其中最受歡迎的是聚-L-賴氨酸(PLL),但很少是生物可降解的。已使用生物可降解聚合物如聚乳酸/乙醇酸(帶負電荷)和聚丙交酯/乙交酯(中性)作為非可溶性顆粒形式的基因載體(Amarueyama等人,NanoparticleDNACarrierWithPLLGraftedPolysallanideCopolymerandPolylaeticAcid,8Bioconjugate,735-739(1997))。一般說來,已知聚陽離子聚合物是有毒性的,并且PLL骨架在生理條件下幾乎不被降解。其繼續留在細胞和組織中,引起不良的高度毒性(A.Segouras&R.Dunlan,MethodsforEvaluationofBiocompatibilityofSyntheticPolymers,1J.Mater.Sci.inMedicine,61-68(1990))。從上述情況可以看出,提供可溶性和生物可降解的基因載體意味著該聚合物基因載體在送遞基因后可在體內分解或降解成無毒性的成分,即提供非病毒的,安全而有效的基因載體將是本領域的重大進展。發明的概要本發明的目的是提供向細胞內送遞核酸的組合物和方法。本發明的另一個目的是提供生物可降解的基因載體組合物、其使用和制造方法。本發明的再一個目的是提供有效的和無毒性的基因送遞組合物和方法。本發明的再一個目的是提供用于向靶細胞內送遞外源性核酸的無毒性、可溶性、生物可降解的非病毒組合物及其使用方法。提供新的包含帶正電荷胺基團之生物可降解酯鍵主鏈的聚合物,即聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸](PAGA),能夠實現這些和其它目的。用作基因送遞載體的組合物包括與有效量的包含待送遞基因的核酸相混合的有效量的PAGA。制造聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸]的方法包括以下步驟(a)用胺封閉劑保護L-賴氨酸的ε-氨基基因,以得到被封閉的L-賴氨酸;(b)使被封閉的L-賴氨酸的α氨基脫去氨基,以得到被封閉的(6-氨基-2(S)-羥基己酸);(c)使被封閉的(6-氨基-2(S)-羥基己酸)聚合,以得到被封閉的聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸];和(d)除去胺封閉基因,使被封閉的聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸]去保護,以得到聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸]。向選擇的細胞內送遞選擇的核酸的方法包括以下步驟(a)將有效量的選擇的核酸與有效量的聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸]混合,以得到復合物;(b)在適于維持細胞存活性的條件下使選擇的細胞與復合物接觸。也可用按照共同待批美國專利申請TNWDocketNo.T6624.NP(其列為本文參考文獻)中所述的相似方法共價連接到導向部分上的聚乙二醇(PEG)接枝作為PLL類似物的本發明的生物可降解基因載體PAGA。附圖的簡要說明圖1顯示制造聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸](PAGA)的解說性合成方案;(ⅰ)H2SO4,NaNO2,CH3CN(54%);(ⅱ)于150℃,10-4mmHg條件下聚合(96%);(ⅲ)HCOOH,Pd-C,DMF(65%)。示出聚-L-賴氨酸(PLL)的結構,以便比較。圖2顯示在水溶液中用MALDI-TOFMS進行的PAGA降解研究;(A)PAGA在3天內的降解和(B)在6個月后的降解。單體峰以外的峰來自基質、緩沖液和鹽。譜線為128次激光發射的總合并且是7點Savitzky-Golay修正平滑的。圖3A-E顯示PAGA/DNA復合物的選擇的正對負電荷比的瓊脂糖凝膠帶移動試驗;“質粒”指示對照DNA;3B-D顯示37℃分別溫育4、8和24小時后,選擇的PAGA/DNA復合物正對負電荷比的瓊脂糖凝膠帶移動試驗;3E顯示37℃分別溫育4、8、24小時和4天后,PLL/DNA復合物的選擇的正對負電荷比的對照瓊脂糖凝膠帶移動試驗。圖4A-H分別顯示(A)質粒DNA(pSV-β-gal);(B),(C):PAGA/DNA復合物;(D)溫育4小時后的PAGA/DNA復合物;(E),(F)溫育8小時后的PAGA/DNA復合物;(G),(H):37℃溫育24小時后的PAGA/DNA復合物的原子力顯微鏡檢(AFM)影象。圖5A-D顯示用PAGA/pSV-β-gal復合物轉染293細胞。5A顯示5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)著染的作為對照的用pSV-β-gal轉染的細胞。5B和5C顯示分別用pLL/pSV-β-gal復合物和PAGA/pSV-β-gal復合物轉染。5D顯示PAGA/pSV-β-gal或PLL/DNA復合物對293細胞的轉染。使用對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)作為底物,根據β-半乳糖苷酶活性的表達測定了轉染效率。對每種聚合物的轉染方案進行優化并于氯奎(100mM)存在下進行。PLL/DNA的轉染效率定作100%。數據以5次實驗的平均值表示。圖6顯示PAGA對細胞的毒性試驗的結果,使用的是3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-溴化四唑(MTT)測定法。在不加聚合物和分別加入濃度為30、100、200及300mg/ml的PAGA和PLL(分子量7kDa和19kDa)的情況下溫育24小時后測定了細胞存活率。將未經聚合物處理的293細胞的存活率定為100%。發明的詳細描述在公開并描述本發明的生物可降解基因載體組合物及其制造和使用方法之前,應明確本發明并不只限于本文所公開的特定化合物構型、方法步驟及材料,因這些都可能略有改變。另外,本文所使用的術語只是用于描述特定實施方案,而不是用于限制本發明的范圍,因為本發明的范圍只是由待批權利要求及其等同物來限定的。必須提到的是,本說明書中和待批權利要求中使用的單數形式冠詞“a”、“an”和“the”,除特別指明者外,還包括復數形式的語詞所指的對象。本文描述了具有酯主鏈的PLL類似物,即,聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸](PAGA)。與PLL不同的是,在生理條件下PAGA可迅速降解。該聚合物具有將DNA縮合成緊湊形式的相似能力,并且其轉染效率甚至大于PLL。因此,PAGA構成一種無毒性的生物可降解基因載體。本文所說的“PLL”是指聚(L-賴氨酸)、其衍生物及其混合物。PLL優選具有約為200至50,000道爾頓的分子量,且更優選具有500至30,000道爾賴的分子量。“PAGA”是指具有酯主鏈的聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸]。PAGA是一種具有強的縮合核酸并將其有效地轉染到細胞內能力的無毒性、水溶性、陽離子型生物可降解聚合物。根據本發明,PAGA的分子量優選在大約4000至100,000道爾頓范圍內。本文所說的“聚(烷氧基)二醇”是指可接枝到PGA或PLL上的聚醚型二醇聚合物。該聚合物的每個單體部分都含有至多約5個碳原子的碳鏈。優選的聚(烷氧基)二醇選自聚乙二醇(PEG)均聚物、聚丙二醇均聚物、α取代的聚(烷氧基)二醇(如甲氧基聚乙二醇或其它適用的α取代的衍生物,如含有C1-C4烷基的衍生物)、聚(烷氧基)二醇共聚物和嵌段共聚物,及其活化的衍生物。本發明中使用的聚(烷氧基)二醇優選具有大約200至50,000,更優選是大約200至20,000的分子量。特別優選的聚(烷氧基)二醇是聚乙二醇(PEG)。因為PEG比較便宜,其已被美國食品與藥物管理局批準用于人體,并且能避免引發抗體反應,所以是優選的。本文所說的“有效量”是指沒有毒性,但足以提供選擇的局部或全身作用,而且在合理的益處/危險比例下能實現任何醫療性能的核酸量。本文所提到的“投用”及相似術語是指,按照本發明向待治療病人體內送遞由待送遞核酸與基因載體組合物相混合所形成的復合物,以致使該復合物能夠經全身循環達到復合物可與靶細胞接觸的身體部位。因此,優選經全身給藥向病人投用該組合物,一般包括皮下、肌肉內、靜脈內或腹腔內投用。可將可注射的割劑制成常規形式,如液體溶液或懸液,或者制成適于注射前在液體中制成溶液或懸液,或制成乳液的固體形式。適當的賦形劑包括水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等,并且必要時也可加入小量的潤濕劑或乳化劑、緩沖劑等輔助物質。本發明涉及無毒性的和生物可降解的,并能夠與核酸形成穩定的可溶性復合物的新的PLL類似物PAGA,及其制備方法。PAGA可以與PEG,以及可被細胞膜受體識別的導向(靶向)部分(TM)共價結合。PAGA能夠與核酸形成復合物,當解離后復合物釋放核酸以轉染幾種類型的細胞,導向部分(TM)使得轉染對含有TM受體的細胞具有選擇性。本發明還提供了體外或體內的特異性細胞轉染方法。有效地向定向細胞送遞核酸之后,PAGA可在生理條件下被降解成無毒性的小單位。因此,與PLL相比,本發明的PAGA大大推進了定向基因送遞。按照其最通用的定義,本發明涉及新的PLL類似物PAGA,以及至少一種帶負電荷的核酸與帶正電荷的生物可降解PAGA之間的復合物,其中核酸與PAGA聚合物之間的締合實質是靜電性決定的。生物可降解PAGA聚合物優選進一步與PEG聚合物結合,其本身還與導向部分結合。加入PEG可阻止由PEG-PLL和核酸形成的復合物(或納米顆粒)的沉淀和聚集,從而增加了復合物的可溶性。PEG與PLL連接也可融合細胞膜并防止核酸受到蛋白酶降解,從而提高了轉染效率。此外,因為PEG可以作為連接PLL枝聚體和導向部分(TM)的接頭,所以其可提高復合物的導向效率。導向部分本身也可直接結合到PAGA上。PEG和/或TM與PAGA結合的方法與用于接枝PLL的方法相似,并可參見共同待批美國專利申請TNWDocketNo.T6624.NP(其列為本文參考文獻)。本發明涉及合成含有可降解酯鍵和帶負電荷主鏈的新的PLL類似物,即聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸](PAGA)。該聚合物能夠結合核酸并形成可用作基因載體的致密復合物。向待轉染的細胞釋放核酸后,聚合物被迅速水解性降解成無毒性的小單位。此外,PAGA/DNA復合物比PLL/DNA復合物表現有較高的轉染效率。如PLL/DNA復合物一樣,PAGA/DNA復合物也沒有毒性。因此,新設計的PAGA可以代替PLL基因載體和以前使用的其它帶正電的聚合物,以提高轉染效率而且無毒性。圖1顯示帶有酯主鏈的PLL類似物PAGA的合成流程。按照本領域已知的方法,用胺封閉基團如芐氧羰基(Cbz)保護L-賴氨酸的ε氨基。然后在α氨基上使所得到的被保護氨基酸脫去氨基,以在該位置產生羥基。經本領域已知的普通方法熔融縮合聚合使這些單體聚合,其中不使用重金屬催化劑,以減少由此引起毒性的可能性。另外,因為聚合反應中的反應物只是單體,所以不產生對活細胞可能有害的產物。然后除去胺封閉基團以使聚合物去保護,從而得到PAGA。本發明的PAGA帶有總的正電荷,借以與核酸形成穩定的復合物。所形成的復合物是大小為1μm至150-250nm的球形,這一大小正好適于經過胞吞作用被細胞攝入(Choi等人,PEGgraftedpoly-L-Lysinesaspolymericgenecarrier,54J.Control.Rel.39-48(1998))。PAGA在生理條件下很容易生物降解,但當其與核酸形成復合物時則降解速度較慢且更為理想。PAGA/DNA的轉染效率約為PLL/DNA的兩倍。另外,與目前使用的PLL一樣,PAGA也是無毒性的。PAGA作為基因載體的新的特征是,PAGA的快速降解可在核內釋放游離DNA,從而可使DNA的表達和轉染更為有效,并且可從細胞區室中迅速除去來自PAGA的降解片段,然后在體內排泄或代謝。因此,與PLL相比,PAGA是安全、有效并顯著改良的基因載體。本發明的PAGA可任選地用于與可逆結合待送遞之生物活性劑的其它藥用寡聚物和/或聚合物形成嵌段共聚物。這樣的寡聚物和/或聚合物優選的是聚陽離子。優選的聚陽離子是聚-L-賴氨酸(PLL)。本發明PAGA的其它潛在的嵌段共聚物包括聚精氨酸、聚鳥氨酸、組蛋白、抗生物素蛋白、魚精蛋白及其混合聚合物。也可利用生物可降解的中性疏水聚合物如聚α-羥基酸與PAGA形成嵌段共聚物。這些有代表性的聚α-羥基酸聚合物均衍生于或選自聚交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。導向部分(TM)可以直接結合到本發明的PAGA上,或者結合到PEG上,然后PEG再結合到PAGA上。TM可以是任何可被細胞膜受體識別的信號成員。例如,三觸角乳糖胺的脫唾液酸寡糖苷、四觸角乳糖胺的脫唾液酸寡糖苷、路易斯X、唾液酸路易斯X、硫酸化路易斯X、寡甘露糖苷、磷酸化寡甘露糖苷、乳糖胺的硫酸化寡糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、木糖或鼠李糖、乳糖酸、葉酸及生物素等被膜凝集素識別的簡單或復雜的寡糖苷。TM也可以是肽,包括抗炎肽,或其被血管細胞識別的某些片段,如小腸血管舒張多肽(IPV);各種整聯蛋白的肽配體;趨化因子如甲酰肽和拮抗劑;肽類激素;或天然代謝物如生物素、四氫葉酸、葉酸或肉堿。TM最好選自乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、木糖或鼠李糖、肽、趨化因子、激素、天然代謝物、生物素、四氫葉酸、葉酸、乳糖酸、脫唾液酸寡糖苷、寡甘露糖苷、磷酸化寡甘露糖苷、乳糖胺的硫酸化寡糖、運鐵蛋白和脫唾液酸糖蛋白。核酸,即DNA和/或RNA的送遞可用于實現多肽的表達,或通過使用“反義”核酸,特別是反義RNA抑制多肽的表達。本文所說的“多肽”是指任何長度的肽并包括蛋白質在內。除特別指出者外,對本文所使用的術語“多肽”的大小沒有任何特殊限制。可被表達的典型多肽選自催產素、血管升壓素、促腎上腺皮質激素、表皮生長因子、促乳素、黃體生成素釋放激素、生長激素、生長激素釋放因子、胰島素樣生長因子、胰島素、紅細胞生成素、肥胖蛋白如leptin,促生長素、胰高血糖素、胰高血糖素樣胰島素趨化因子、甲狀旁腺激素、干擾素、胃泌素、白介素-2和其它白介素以及淋巴因子、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿胃泌素、胰泌素、降鈣素、腦啡肽、內啡肽、血管緊張肽、腎素、緩激肽、桿菌肽、polymixins、粘菌素、短桿菌酪肽、短桿菌肽,及其合成的類似物、修飾物及其藥理活性片段、單克隆抗體及疫苗。多肽并不只限上述的這一組例子,對可被表達的肽或蛋白質的唯一限制是功能性的。DNA和/或RNA的送遞可用于基因治療、疫苗接種及應在體內投用核酸或多肽的任何治療情況(如參見美國專利No.5,580,859,在此列為本文參考文獻)。當核酸是DNA時,其可以是本身不能復制的DNA序列,但將其插入到進一步包括復制基因的質粒中則可以復制。DNA也可含有轉錄啟動子,如可在人體內發揮功能的CMV1EP啟動子。DNA也可以編碼轉錄DNA所需的聚合酶。在哺乳動物體內表達克隆基因的許多表達載體都是本領域已知的,并且許多這樣的表達載體都可從市場上購得,例如pEUK-Cl(可購自Clontech,PaloAlto,Calif)。可利用本領域已知的重組DNA技術(例如J.Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,1989),在此列為本文參考文獻),將感興趣的基因插入到這樣的表達載體中。本發明的無毒性生物可降解PAGA可與能夠有效地轉染哺乳動物細胞的核酸形成穩定的并且可溶的復合物。核酸可選自下列條目a)基因標志,如熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、氯霉素乙酰轉移酶基因、賦予抗生素如潮霉素或新霉素抗性的基因;b)用于治療目的的基因,如編碼在高膽固醇血癥(肝)病例中缺乏的低密度脂蛋白受體、凝血因子、腫瘤基因抑制劑、主要組織相容性蛋白抗癌基因、有義和反義RNA及核酶的基因;以及c)以用作疫苗的基因,如編碼病毒抗原的基因。本發明的體外或體內轉染方法包括在下述條件下將核酸與無毒性生物可降解PAGA的復合物導入含有待轉染細胞的培養基中培養基中的復合物進入細胞的胞漿,將上述復合物的核酸釋放到細胞的胞質溶膠中,核酸在被轉染細胞中轉錄并表達。該方法可用于治療與特異性多肽的缺陷或缺乏或突變有關的疾病。根據本發明的另一個方面,該方法提供免疫人或動物個體的方法,包括向個體體內送遞DNA和/或RNA,其中DNA和/或RNA編碼可引發抗免疫原之免疫反應的免疫原性翻譯產物。該方法可用于引發體液免疫反應、細胞免疫反應,或兩種混合的免疫反應。本發明還涉及使用核酸與本發明的聚合物基因載體所形成的復合物轉染可選自下列一組中的細胞造血系細胞、肝細胞、骨骼肌細胞、皮膚細胞如成纖維細胞、角質細胞、樹突細胞、或黑色素細胞;血管壁細胞如內皮細胞或平滑肌細胞;呼吸道的表皮細胞;中樞神經系統的細胞;癌細胞;免疫系統的細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞等。本發明的再一個方面涉及使用PAGA作為藥物送遞載體的方法。無毒性、生物可降解的并帶有正電荷的PAGA可與帶負電荷的分子如蛋白質、肽及其它生物活性分子形成復合物。PAGA也可用于制造含藥物的不溶性顆粒,如納米顆粒或微球。作為方法的舉例,可以合成任選地接枝有PEG聚合物的PAGA,以形成本發明的基因載體。本發明的無毒性、生物可降解PAGA可以與核酸如DNA或RNA自發地形成縮合的復合物。如果PAGA接枝到PEG上,可增加復合物的溶解度及轉染效率。該靜電復合物是靠帶正電荷的聚合物(如PAGA)和帶負電荷的核酸之間的親和性形成的。也可任選地將導向部分(TM)結合到PAGA或PEG上,以定向將基因送遞到靶細胞內。下列實施例用于舉例說明合成PAGA的方法,生物可降解基因載體的組合物及使用本發明的組合物的方法。實施例1PAGA的合成將L-賴氨酸的α氨基轉化成羥基,以制得新的單體L-羥基賴氨酸(圖1)。借助熔融縮合使該單體聚合。因為唯一的反應物是單體,所以聚合中不會產生有害的副產物。按照本領域已知的方法,用胺封閉劑如芐氧羰基(Cbz)保護L-賴氨酸的ε氨基。然后使被保護的氨基酸在α氨基處脫氨基,得到該位置為羥基的產物。以熔融縮合聚合法使這些單體聚合,因沒有使用重金屬催化劑,從而減少了由之產生毒性的可能性。另外,由于聚合反應中的反應物只是單體,所以不產生可能對活細胞有害的加合物。然后除去胺封閉基因使聚合物去保護,得到PAGA。PAGA和PLL只是在主鏈鍵上有所不同。PAGA中是酯鍵,而PLL中是酰胺鍵。使用基質輔助的激光解吸/離子化飛行時間質譜法(MALDI-TOFMS)確定降解的帶正電荷PAGA的分子量。實施例2PAGA的降解用基質輔助的激光解吸/離子化飛行時間質譜法(MALDI-TOFMS)研究了PAGA的分子量分布(MWD)和降解動力學(圖2A-B和表1)。將按照實施例1方法制備的PAGA以1納摩爾(5mg/ml)的濃度溶解在25mMHEPES(pH7.3)中,并于37℃溫育。基質是在水/3%TFA/乙腈(4∶1∶6,v/v/v)中按10mg/ml的濃度制備的α-氰基-4-羥基肉桂酸(αCHCA)溶液。以選定的時間間隔,將1μl等分的PAGA溶液加到微量離心管內的9μl基質溶液中。將1μl等分的該混合物加到MALDI樣品板上并真空干燥。在VoyagerBiospectrometryWorkstation(PerceptiveBiosystems)中使用有3-ns脈沖的337nmN2激光幅射。以陽離子方式使激光脈沖產生的離子加速到29kV能量。所有光譜均以同樣的激光力得到。與完整的PAGA相比,在緩沖液(pH7.3)中溫育5小時后PAGA的分子量降低至小于30%(圖2A)。2小時后,PAGA的降解速度變得很慢。PAGA的快速降解似乎主要是由于ε氨基通過水解酯鍵而自身降解所致。6個月后聚合物逐漸接近完全降解,并且最終降解產物是單體L-羥基賴氨酸(圖2B)。大約2/3的原聚合物在5小時內降解,并在6個月后逐漸達到幾乎完全降解(表1)。Mp代表降解聚合物的分子量,根據MALDI光譜中的最高峰強度確定最可能的峰值分子量。最終降解產物為單體L-羥基賴氨酸(圖2B)。還在同樣條件下或在假細胞外環境中對PLL進行了降解研究。甚至在3個月后,PLL仍很難降解。表1.由MALDI-TOFMS測得的PAGA降解數據PAGA在pH7.3緩沖液中37℃溫育。a根據MALDI光譜中最高峰值強度確定的最可能的峰值分子量。b單體的分子量。數據為三次不同實驗的平均值±標準誤。實施例3PAGA與DNA形成復合物的能力用瓊脂糖凝膠帶移動試驗確定PAGA的DNA縮聚能力(圖3A-E)。將按照實施例1的方法制備的PAGA與質粒DNA(pSV-CAT;Promega,Madison,Wisconsin)按各種不同的正電荷(PAGA)對負電荷(DNA)比例混合在一起,然后經瓊脂糖凝膠電泳分級分離之。當正電荷對負電荷的比例約達到1∶1時,DNA磷酸二酯主鏈的負電荷與PAGA的正電荷開始產生強復合物。因為PAGA在溶液中降解很快,因此有必要證實PAGA/DNA復合物具有發生轉染所需的足夠穩定性。將復合物于37℃溫育一定時間后,檢測從復合物上解離的DNA以研究PAGA/DNA復合物的穩定性。圖3B-D顯示于37℃分別溫育4,8和24小時后,有特定正對負電荷比例的PAGA/DNA復合物的瓊脂糖凝膠電泳帶移動試驗結果,其中DNA/PAGA復合物在1天的過程中緩慢降解,直到完全降解。復合物比單獨PAGA有較高的穩定性可能是由于PAGA的氨基與DNA的磷酸基締合所致。另外,部分降解的PAGA保持其與DNA形成復合物的能力。在相似條件下,4天里對照組PLL/DNA復合物一直是穩定的。實施例4PAGA/DNA復合物的大小和結構使用原子力顯微鏡檢法(AFM)估測PAGA/DNA復合物的大小和結構。將2μl溶于HEPES-Mg緩沖液(25mMHEPES,10mMMgCl2)中的DNA(pSV-CAT,5μg/ml),和按照實施例3的方法制備的PAGA/DNA復合物(50μg/ml)分別涂敷在新切割的云母基片上。以相似處理的PLL/DNA作為對照。使溶液吸附2分鐘,然后用1ml蒸餾水洗并在N2氣流中迅速干燥。為了得到PAGA/DNA復合物和降解的復合物影象,將pSV-β-gal質粒溶液(5μg/ml水溶液)與等體積PAGA水溶液混合制成復合物。37℃溫育復合物溶液,以使復合物發生降解。在適當時間間隔得到AFM影象。使用配有E掃描器的NanoscopeⅢa(DigitalInstruments,SantaBarbara,CA)進行AFM。所有的AFM成象均為常規的外界敲擊方式。所有可能形式的質粒DNA,包括超螺旋、帶切口的環狀及線性質粒DNA均可在AFM影象中看到(圖4A)。測知裸質粒DNA的大小約為1μm。PAGA和DNA之間自組裝復合物的形成可在圖3B和C中電荷比例(+/-)為5∶1時看到。復合物的形狀大多為球形,但很不均勻。復合物于37℃溫育4小時后,可見降解開始(圖4D)。可以看到從致密核心伸出的DNA鏈,且致密核心的形狀成為均勻的并且呈球狀。致密核心被認為是縮聚狀態。溫育8小時后,從復合物中釋放出更多的DNA(圖4E,F)。24小時溫育影象的兩個表觀特征是,大多數DNA從復合物中釋出,并且復合物的密度明顯降低(圖H)。這些結果表明,幾乎全部DNA已從復合物中釋出。復合物的降解速度比單獨PAGA慢可能是由于聚合物中的ε氨基被DNA磷酸酯封閉所致。因為細胞的最大轉染只需幾個小時,所以可利用PAGA/DNA復合物作為細胞攝入所需的穩定的復合物系統。PAGA/DNA復合物的大小分布為大約150nm至250nm,表明PAGA與用其它基因載體系統所觀察到的一樣將DNA縮聚成緊湊形狀(參見D.D.Dunlap等人,NanoscopicStructureofDNACondensedforGeneDelivery,25NucleicAcidsRes.,3095-3101(1997);M.A.Wolfert等人,CharacterizationofVectorsforGeneTherapyFormedbySelf-assemblyofDNAwithSyntheticBlookCo-polymers,7Hum.Gene.Ther.,2123-2133(1996))。與PLL/DNA復合物的形狀相似,該復合物也是球形和扁圓形的。實施例5PAGA/DNA復合物的轉染效率使用293T細胞系估測PAGA/DNA復合物的轉染效率。以前該細胞系被用于估測聚(乙二醇)-PLL嵌段共聚物的轉染能力(D.D.Dunlap等人,NanoscopicStructureofDNACondensedforGeneDelivery,25NucleicAcidsRes.,3095-3101(1997))。轉染前24小時,以6×104細胞/孔的密度將293T細胞接種在24孔平板中。恰好在與DNA混合前,將按實施例1所述方法制備的PAGA載體溶于水中,以盡可能減少其在水溶液中的迅速降解。將pSV-β-gal(10μg/ml;Promega)和PAGA在無FBS細胞培養基中混合并于室溫下溫育20分鐘,以制備質粒PAGA/pSV-β-gal復合物。分別以10%(v/v)和100μM的終濃度加入FBS和氯奎。用轉染混合物替換24孔平板中的培養基,然后37℃溫育4小時。溫育后,再用新鮮培養基替換轉染混合物。將細胞37℃繼續溫育28小時。使用β-半乳糖苷酶測定系統(Promega,Madison,Wisconsin)或原位X-gal染色法測定被轉染細胞中的β-半乳糖苷酶活性(參見PromegaTechnicalBulletinNo.097,β-galactosidaseEnzymeAssaySystemWithReporterLysisBuffer(1996))。在PAGA/pSV-β-gal復合物重量比為1∶20時觀察到明顯的轉染能力(圖5A);PAGA/DNA復合物的轉染效率約為對照PLL/DNA復合物的兩倍。圖5B-C顯示如體外染色所判定的,用PAGA/pSV-β-gal復合物轉染的細胞表達β-半乳糖苷酶。如原位染色所示,被轉染的表達β-半乳糖苷酶的細胞被染成蘭色。細胞本身沒有內源性β-半乳糖苷酶活性。還于體外評估了PAGA/DNA復合物的轉染效率(圖5D)。在PAGA∶DNA重量比為10∶1時,PAGA顯示對293細胞有最佳轉染效率。在最佳條件下,PAGA/DNA復合物對293細胞的轉染效率差不多是PLL/DNA復合物的兩倍。PAGA相對于PLL提高了轉染效率似乎是由于PAGA的無毒性性質。實施例6PAGA對細胞的毒性使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-溴化四唑(MTT)測定法測定了PAGA對細胞的毒性(參見Mosman,T.,Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays,65J.Immunol.Methods,55-63(1983))。不加聚合物,或分別加入濃度為30、100、200和300mg/ml的PAGA和PLL(分子量7kDa和19kDa)溫育24小時后測定細胞存活性。將未經聚合物處理的細胞的存活率定為100%。293T細胞與100μg/mlPAGA一起溫育24小時后,細胞群體中的細胞數沒有降低,細胞形態也沒有改變。相反,細胞與PLL一起溫育則可見細胞存活率較低(25%),細胞成顆粒狀,而且在同樣濃度下細胞群體減少(圖6)。當PAGA濃度高達300μg/ml時,對細胞仍沒有毒性。不存在DNA時使用某些聚合物未見有明顯較大的毒性(M.A.Wolfert等人,Hume.GeneTher.7∶2121(1996))。在這方面,沒有DNA復合時PAGA無毒性是顯而易見的。據我們所知,不存在這樣的基因載體,即沒有DNA復合時不表現出細胞毒性。因此,本發明的PAGA不存在這樣的基因載體,即具有下列特征ⅰ)它是生物可降解的,即在生理條件下可快速降解,但當與DNA形成復合物時降解速度減慢;ⅱ)最終降解產物為天然產物,即L-羥基賴氨酸;ⅲ)其縮聚DNA使之呈總體球形;ⅳ)PAGA本身是無毒性的;和ⅴ)PAGA/DNA復合物的轉染效率約為PLL/DNA復合物的兩倍。PAGA的快速降解將向核內釋放游離DNA,從而可使DNA的表達和轉染更為有效。由PAGA降解的片段或單體L-羥基賴氨酸可很容易地被代謝成受賴氨酰氧化酶催化的羧酸,并從細胞區室中迅速除去,然后在體內排泄或代謝。幾篇研究論文表明了賴氨酰氧化酶存在于人體中(37Appl.Microbiol.Biotochnol.,599-603(1992))。因此,利用PAGA作為可經連接模塊功能(如受體介導的胞吞作用的配體,即核內體破裂功能,或核定位信號)而修飾的基因載體構架,很可能實現安全的基因治療。這些實施例只是用于舉例說明本發明,本領域技術人員會意識到或能夠確信,使用一般的常規實驗可對本文所述的本發明的具體實施方案作出許多等同改動。這些等同改動將包括在下列權利要求范圍內。權利要求1.聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸](PAGA)。2.權利要求1的聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸](PAGA),其中PAGA的分子量約為4,000至100,000道爾頓。3.嵌段共聚物,包括與選自下列一組中的聚合物共聚的權利要求2的PAGA聚-L-賴氨酸(PLL)、聚精氨酸、聚鳥氨酸、組氨蛋白、抗生物素蛋白、魚精蛋白、聚交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)及其混合物。4.根據權利要求3的嵌段聚合物,其中聚合物選自聚-L-賴氨酸(PLL)、聚精氨酸、魚精蛋白及其混合的聚合物。5.根據權利要求4的嵌段聚合物,其中聚合物選自聚-L-賴氨酸(PLL)、聚精氨酸、聚鳥氨酸、組蛋白、抗生物素蛋白、魚精蛋白及其混合物。6.用作基因送遞載體的組合物,包括與有效量的核酸混合的,有效量的根據權利要求1-5中任一項的聚合物。7.權利要求6的組合物,其中所說的PAGA含有至少兩個表面胺基團。8.權利要求6的組合物,其中所說的PAGA是與兩親聚合物共價結合的。9.權利要求8的組合物,其中所說的兩親聚合物是聚烷氧基乙二醇。10.權利要求11的組合物,其中所說的聚烷氧基二醇選自聚乙二醇均聚物(PEG)、甲氧基聚乙二醇均聚物(mPEG)、聚丙二醇均聚物、α-取代的聚(烷氧基)二醇、聚(烷氧基)二醇共聚物和嵌段共聚物,及其活化的衍生物。12.權利要求11的組合物,其中所說的聚烷氧基二醇的分子量約為200至50,000。13.權利要求12的組合物,其中所說的聚烷氧基二醇的分子量約為200至20,000。14.權利要求10的組合物,其中所說的兩親聚合物是聚乙二醇(PEG)。15.權利要求6的組合物,其進一步包括被細胞膜受體識別的導向部分(TM)。16.權利要求11的組合物,其中導向部分(TM)選自乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、肽、趨化因子、激素、天然代謝物、生物素、四氫葉酸、葉酸、乳糖酸、脫唾液酸寡糖苷、寡甘露糖苷、磷酸化寡甘露糖苷、乳糖胺的硫酸化寡糖、運鐵蛋白和脫唾液酸糖蛋白。17.權利要求6的組合物,其中核酸包括編碼待送遞之基因的DNA或RNA序列。18.權利要求6的組合物,其中核酸包括編碼選自下列一組中的遺傳標志的DNA序列熒光素酶基因、β半乳糖苷酶基因、潮霉素抗性、新霉素抗性和氯霉素乙酰轉移酶。19.權利要求6的組合物,其中核酸包括編碼選自下列一組之蛋白質的DNA序列低密度脂蛋白受體、凝血因子、腫瘤基因抑制劑、主要組織相容性蛋白、抗癌基因、p16、p53、胸苷激酶、IL2、IL4和TNFa。20.權利要求6的組合物,其中核酸包括編碼病毒抗原的DNA序列。21.權利要求6的組合物,其中核酸編碼選自有義RNA、反義RNA和核酶的RNA。22.權利要求6的組合物,其中核酸編碼凝集素、甘露糖受體、唾液酸粘附素,或逆轉錄病毒反式激活因子(TAT)。23.生產聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸]的方法,其包括以下步驟(a)用胺封閉劑保護L-賴氨酸的ε-氨基基因,以得到被封閉的L-賴氨酸;(b)使被封閉的L-賴氨酸的α氨基脫去氨基,以得到被封閉的(6-氨基-2(S)-羥基己酸);(c)使被封閉的(6-氨基-2(S)-羥基己酸)聚合,以得到被封閉的聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸];和(d)除去胺封閉基因,使被封閉的聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸]去保護,以得到聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸]。24.根據權利要求18的方法制備的組合物。25.向選擇的細胞內送遞選擇的核酸的方法,其包括以下步驟(a)將有效量的選擇的核酸與有效量的根據權利要求1-5任一項的聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸](PAGA)或PAGA共聚物混合,以得到復合物;(b)在適于維持細胞存活性的條件下使選擇的細胞與復合物接觸。26.轉化細胞的方法,其包括在權利要求6的組合物進入所說的細胞,并且釋放所說的組合物的核酸的條件下使所說的細胞與所說的組合物接觸。27.權利要求26的方法,其中所說的PAGA包含至少兩個表面氨基團。28.權利要求21的方法,其中所說的PAGA共價結合到兩親性聚合物上。29.權利要求28的方法,其中所說的兩親性聚合物是聚烷氧基二醇。30.權利要求29的方法,其中所說的聚烷氧基二醇選自聚乙二醇均聚物(PEG)、甲氧基聚乙二醇均聚物(mPEG)、聚丙二醇均聚物、α-取代的聚(烷氧基)二醇、聚(烷氧基)二醇共聚物和嵌段共聚物,及其活化的衍生物。31.權利要求30的方法,其中所說的聚烷氧基二醇的分子量為大約200至50,000。32.權利要求31的方法,其中所說的聚烷氧基二醇的分子量約為200至20,000。33.權利要求32的方法,其中兩親線性聚合物是聚乙二醇(PEG)。34.轉染攜帶有識別導向部分(TM)受體的細胞的方法,其包括在權利要求10的組合物進入所說的細胞并釋放所說組合物的核酸的條件下,使所說的細胞與含有所說組合物的組合物接觸。35.根據權利要求34的方法,其中所說的導向部分(TM)是選自下列一組中的成員乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、木糖或鼠李糖、肽、趨化因子、激素、天然代謝物、生物素、四氫葉酸、葉酸、乳糖酸、脫唾液酸寡糖苷、寡甘露糖苷、磷酸化寡甘露糖苷、乳糖胺的硫酸化寡糖、運鐵蛋白和脫唾液酸糖蛋白。36.根據權利要求35的方法,其中所說的TM選自乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、木糖或鼠李糖。37.根據權利要求35的方法,其中所說的TM是選自于下列一組的成員肽、趨化因子、激素、天然代謝物、生物素、四氫葉酸、葉酸及乳糖酸。38.根據權利要求35的方法,其中所說的TM是選自下列一組中的成員脫唾液酸寡糖苷、寡甘露糖苷、磷酸化寡甘露糖苷、乳糖胺的硫酸化寡糖、運鐵蛋白和脫唾液酸糖蛋白。39.根據權利要求35的方法,其中TM是含有選自乳糖和半乳糖的糖的半乳糖。40.根據權利要求34的方法,其中核酸包括編碼基因的DNA或RNA序列。41.根據權利要求34的方法,其中核酸包括編碼選自下列一組中的遺傳標志的DNA序列熒光素酶基因、β半乳糖苷酶基因、潮霉素抗性、新霉素抗性和氯霉素乙酰轉移酶。42.根據權利要求34的方法,其中核酸包括編碼選自下列一組之蛋白質的DNA序列低密度脂蛋白受體、凝血因子、腫瘤基因抑制劑、主要組織相容性蛋白、抗癌基因、p16、p53、胸苷激酶、IL2、IL4和TNFa。43.根據權利要求34的方法,其中核酸包括編碼病毒抗原的DNA序列。44.根據權利要求34的方法,其中核酸編碼選自有義RNA、反義RNA和核酶的RNA。45.根據權利要求34的方法,其中核酸編碼凝集素、甘露糖受體、唾液酸粘附素,或逆轉錄病毒反式激活因子(TAT)。46.包括與有效量的帶負電荷分子復合的有效量聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸](PAGA)或權利要求3-5中任一項的共聚物的藥物送遞組合物。47.根據權利要求46的藥物送遞組合物,其為不溶性顆粒。48.根據權利要求47的藥物送遞組合物,其中不溶性顆粒是納米顆粒或微球。49.根據權利要求46的藥物送遞組合物,其中帶負電荷的分子是肽、蛋白質或非可溶性藥物分子。全文摘要本發明公開了作為適合于將基因送遞到細胞中的聚[α-(4-氨丁基)-L-乙醇酸](PAGA)。還公開了制造和使用PAGA的方法。文檔編號C08G63/685GK1313873SQ99809830公開日2001年9月19日申請日期1999年7月13日優先權日1998年7月13日發明者J·S·樸,Y·H·車,S·W·金申請人:表達遺傳學公司
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