專利名稱:生產(chǎn)肽的方法，用于生產(chǎn)肽的重組質(zhì)粒和用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞的制作方法
本發(fā)明涉及應(yīng)用遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)肽的方法、用于生產(chǎn)肽的重組質(zhì)粒和用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞。
關(guān)于用轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞和培養(yǎng)轉(zhuǎn)移基因接受體來(lái)生產(chǎn)肽已經(jīng)作了各種嘗試。其中的實(shí)例與近似的計(jì)算產(chǎn)率一并闡述如下。
1.BPV(牛乳頭狀瘤病毒)小鼠C127系統(tǒng)人體IFN-γ基因(cDNA)，SV40早期啟動(dòng)區(qū);3×105單位/毫升(R.Fukunaga等，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA.81，5086(1984));
2.SV40-CV-1系統(tǒng)人體IFN-β基因(cDNA)，SV40早期啟動(dòng)區(qū);2×104單位/毫升(D.Gheysen等，J.Mol.Appl.Genetics，1，305(1982));
3.SV40-COS系統(tǒng)人體胰島素基因(cDNA)，SV40早期啟動(dòng)區(qū)(O.Laud等，J.Biol.Chem.，258，6043(1983));
4.Eco-gpt-CHO系統(tǒng)人體IFN-γ基因(cDNA)，SV40早期啟動(dòng)區(qū);1×104單位/毫升(T.Kadotani等，Seikagaku，56，915(1984));和5.dhfr-CHO系統(tǒng)人體IFN-γ基因(cDNA)，SV40早期啟動(dòng)區(qū);1×105單位/毫升(S.Scahill等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，4654(1983))。
盡管這些方法中每個(gè)方法都有其特點(diǎn)，但每個(gè)方法仍然都不能令人滿意，特別是在所需要的肽的產(chǎn)率方面更是如此。
在生產(chǎn)單克隆抗體肽方面，骨髓瘤已用作產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，然而將他們用于生產(chǎn)其他肽方面至今仍無(wú)所知。
本發(fā)明涉及用轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞，特別是骨髓瘤細(xì)胞生產(chǎn)肽的方法，包括轉(zhuǎn)化細(xì)胞和培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明尤其涉及生產(chǎn)所需肽的方法，包括用重組體質(zhì)粒作為載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，該重組體質(zhì)粒在所需的肽的編碼基因的5′末端上行鏈和3′末端下行鏈兩者上都具有SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序，然后培養(yǎng)由此轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及大量生產(chǎn)所需肽的方法，包括用重組體質(zhì)粒作為載體轉(zhuǎn)化骨髓瘤細(xì)胞，該重組體質(zhì)粒在用于所需要的肽編碼基因的5′末端上行鏈和3′末端下行鏈兩者上都具有SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序。
骨髓瘤細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)在于，他們具有在體內(nèi)和體外迅速生長(zhǎng)的能力，他們具有高度合成蛋白質(zhì)的能力(相對(duì)于IgG而言);他們能夠使細(xì)胞密度增至很高倍數(shù)。作為該實(shí)施例的一個(gè)顯著特點(diǎn)，本發(fā)明通過(guò)將上述骨髓瘤細(xì)胞的有利特征與SV40啟動(dòng)區(qū)和強(qiáng)化因子強(qiáng)有力地表達(dá)出的增強(qiáng)效應(yīng)相結(jié)合，可以成功地產(chǎn)生大量的肽。
此外，本發(fā)明涉及一種重組體質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有處于用于合成所需要的肽的編碼基因的5′末端上行鏈及3′末端下行鏈上的SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序，并涉及用該重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞。
圖1和圖2載體構(gòu)造圖。
圖3和圖4顯示DNA片段的限制圖。
圖5～12顯示所用各個(gè)質(zhì)粒的粗糙型限制圖。
將引入動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)粒加入到動(dòng)物染色體DNA中并保持其穩(wěn)定。基因產(chǎn)物即肽穩(wěn)定地由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生，而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞又能夠長(zhǎng)久地存活著。
不產(chǎn)生骨髓瘤細(xì)胞或不分泌(就IgG而言)骨髓瘤細(xì)胞的用途是能夠避免IgG的污染，因此有利于所需的肽的純化。此外，由于骨髓瘤細(xì)胞能夠在動(dòng)物，例如在小鼠的腹膜腔內(nèi)增殖，所以基因產(chǎn)物(肽)預(yù)計(jì)可以作為副產(chǎn)品大量產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)就是使用帶有位于所需肽(如IFN)編碼異源基因的5′末端上行鏈和3′末端下行鏈兩者上的SV40啟動(dòng)區(qū)，使基因產(chǎn)物的產(chǎn)率增加到大約10倍。
用作宿主細(xì)胞的細(xì)胞可以是上述的各種骨髓瘤細(xì)胞，例如小鼠、大鼠和人體的骨髓瘤細(xì)胞，其中從產(chǎn)品純化的角度來(lái)看，非IgG產(chǎn)生的或非IgG分泌的細(xì)胞較為適宜。P3-X63-Ag8-U1(不分泌型)HGPRT、X63-Ag8-6.5.3(不產(chǎn)生型)HGPRT和SP2/O-Ag14(不產(chǎn)生型)HGPRT等細(xì)胞系都是大鼠骨髓瘤細(xì)胞系的例子，并已為大家熟知(Munemura編《細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)》，Kodansha，東京，1982年)Iwasaki等，《單克隆抗體》，Kodanrha，東京，1982年)。
準(zhǔn)備應(yīng)用的載體最好具有能在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生基因表達(dá)的有效的啟動(dòng)區(qū)(如SV40啟動(dòng)區(qū)、BPV啟動(dòng)區(qū)、金屬硫因(metallothionein)啟動(dòng)區(qū)、dhfr啟動(dòng)區(qū)、各種長(zhǎng)度末端的還原病毒的重復(fù)或已為公眾所熟知的所有LTRS)和選擇的標(biāo)志。選擇的標(biāo)志可以是如上所述的，例如，Eco-gpt、tk和dhfr所有這些都是人們熟悉的。其他熟知的選擇標(biāo)志也可以應(yīng)用。
SV40啟動(dòng)區(qū)的堿基順序已公諸于《科學(xué)》雜志(Seience，200，495～498，(1978))。一種載體(在其中將SV40啟動(dòng)區(qū)與合成多肽所需的基因相結(jié)合)的建造可輕易地由一位熟悉該領(lǐng)域的作業(yè)人員來(lái)完成。例如可參閱下面所提供的實(shí)施例。用于載體建造所需的DNA片段的切割、合成、分析、分離和其他處理都可用常規(guī)技術(shù)(Am.J.Hum.Genet，31，531(1979);T.Maniatis等“分子的克隆”，冷泉實(shí)驗(yàn)室(1982))。
原生質(zhì)體融合方法和磷酸鈣方法等都能用于通過(guò)將基因引入動(dòng)物細(xì)胞的重組質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞。(Mol.Cell.Biol.，1(8)，743～753(1981);Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，825～829(1983);OgawaraWakariyasui Idenshi Kumikae(可理解的基因重組)，144～165頁(yè)，Hirokawa Shoten，Tokyo(1985))。
在體外或體內(nèi)都能有效地進(jìn)行細(xì)胞增殖。
適宜地選擇細(xì)胞增殖系統(tǒng)決定于高效地產(chǎn)生所需的肽的條件和目的(Iwasaki等Tankuron Kotai(單克隆抗體)，Kodansha，Tokyo(1982))。
用于體外培養(yǎng)，可以用一般用于體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基如加有10%(體積/體積)牛犢胎盤(pán)血清(FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)基或加有10%(體積/體積)FCS或人造血清的RDF培養(yǎng)基(RPMI-1640∶DMEM∶F12＝8∶1∶1)。(添加物第27號(hào)，Tanpakushitsu，Kakusan，Koso(蛋白質(zhì)，核酸和酶)，453～455(1984))。
在體外培養(yǎng)可用培替氏培養(yǎng)皿和旋轉(zhuǎn)瓶。使用空心絲的高密度培養(yǎng)法也是頗有效益的。體外培養(yǎng)可以用各種熟知的方法處理(Munemura編Saibo Baiyo Manual(細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè))，Kosansha，Tokyo(1982)和Fukui等編Saibo Baiyo Gijutsu(細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù))，Kodansha，Tokyo，1985)。因此，舉例而言，體外細(xì)胞培養(yǎng)是在5%二氧化碳存在下進(jìn)行的。
體內(nèi)骨髓瘤細(xì)胞的增殖可以在本領(lǐng)域熟知的動(dòng)物的腹膜腔內(nèi)進(jìn)行。動(dòng)物，特別是上面已經(jīng)提及的小鼠品種Balb/c nu/nu或Balb/c，有可能將骨髓瘤細(xì)胞移植在其腹膜腔內(nèi)。
要產(chǎn)生的肽對(duì)本發(fā)明而言其要求并不嚴(yán)格。這些肽的實(shí)例包括淋巴激活素，如干擾素、腫瘤壞死因子和中間白細(xì)胞素(Interleukin);激素，如胰島素和生長(zhǎng)激素;抗原蛋白，如肝炎疫苗和流感疫苗;組織血纖維蛋白溶酶原激活因子和促生長(zhǎng)因子。
產(chǎn)生的肽可用已知方法分離和純化。
下面所述的以使用γ干擾素(γ-IFN)作為使用肽的實(shí)例的實(shí)施例，將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例Ⅰ.載體的建造(圖1)a.γ-IFN基因插入基本載體用克列諾片段(klenow fragment)在最接近SV40早期啟動(dòng)區(qū)后面的Bgl Ⅱ位點(diǎn)上切割質(zhì)粒pKSV-10(Pharmacia P-L Biochemicals;見(jiàn)圖5，該質(zhì)粒的Kpn Ⅰ位點(diǎn)-BamHI位點(diǎn)片段的限制圖，見(jiàn)圖5)切成鈍端，爾后插入一個(gè)Sma Ⅰ聯(lián)結(jié)子(Takara Shuzo)。由此得到的質(zhì)粒pKSV-10-Sma Ⅰ(見(jiàn)圖6)在大腸桿菌HB101中繁殖。
另外，用Bam Ⅲ和BamHI處理含有人體γ-IFN基因的質(zhì)粒pMK-5(以大腸桿菌MK-5形態(tài)保藏在發(fā)酵研究所，保藏號(hào)FERM P-8736，見(jiàn)圖11)。如此切割的γ-IFN基因(基因組)用克列諾片段使之成為鈍端，并在Sma Ⅰ位點(diǎn)插入到pKSV-10-Sma Ⅰ中，得到pKSV-10-γ(見(jiàn)圖7)。
b.選擇標(biāo)志Eco-gpt基因插入pKSV-10-γ用Pvu Ⅱ和EcoRⅠ處理質(zhì)粒pSV-2-gpt(Bethesda研究室(見(jiàn)圖8)或ATCC No.37145)。如此切割的Eco-gpt片段與通過(guò)用Sma Ⅰ和EcoRⅠ處理質(zhì)粒pUC13(Pharmacia P-L Biochemicals)得到的片段連接，得到質(zhì)粒pUC13-sv-gpt(見(jiàn)圖9)。用BamHⅠ從所述pUC13-SV-gpt切割Eco-gpt基因(SV40啟動(dòng)區(qū)+Eco-gpt+SV終止區(qū))。將得到的片段(其限制圖示于圖4)在BamHⅠ位點(diǎn)插入pKSV-10-γ(見(jiàn)圖7)(在γ-IFN基因3′末端鏈上的SV40終止區(qū)末端上具有BamHⅠ位點(diǎn))得到pKSV-10-γ-gpt(見(jiàn)圖10)。
由于上述Eco-gpt基因在5′末端下行鏈上具有SV40早期啟動(dòng)區(qū)，所以在上述建造的質(zhì)粒中的γ-IFN基因處于兩個(gè)SV40啟動(dòng)區(qū)之間的夾層。這個(gè)質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)化。
c.選擇標(biāo)志tk引入pKSV-10-γ(見(jiàn)圖2)
用BamHⅠ從質(zhì)粒pFG-5(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，3757(1979))切割tk基因(tk啟動(dòng)區(qū)+tk+tk終止區(qū))并在BamHⅠ位點(diǎn)插入到pKSV-10-γ(見(jiàn)圖7)，得到質(zhì)粒pKSV-10-γ-tk(見(jiàn)圖12)。這個(gè)質(zhì)粒只在γ-IFN基因的5′末端鏈上具有一個(gè)SV40早期啟動(dòng)區(qū)，可用于轉(zhuǎn)化。
Ⅱ.轉(zhuǎn)化骨髓瘤品系的建立a.通過(guò)原生質(zhì)體融合引入質(zhì)粒(1)原生質(zhì)體的制備將帶有載體pKSV-10-γ-gpt(見(jiàn)圖10)的大腸桿菌在37℃條件下培養(yǎng)在含有葡萄糖(最終濃度為1(重量/體積)%)和氨芐青霉素(最終濃度為50微克/毫升)(最終體積為50毫升)的L肉湯(LB)中，至在600nm時(shí)濁度(光密度)為0.5，在4℃條件下進(jìn)行連續(xù)處理。培養(yǎng)肉湯在3，000rpm離心15分鐘，沉淀物用含有20(重量/體積)%蔗糖的0.05摩爾三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8)沖洗，加入1.25毫升相同的緩沖液，攪拌混合物。加入0.25毫升溶菌酶(Sigma)(溶于0.25摩爾三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8)至5毫克/毫升)，生成的混合物可靜置5分鐘。在另外再加0.5毫升的0.25摩爾EDTA后將混合物靜置5分鐘。
將0.5毫升的0.05摩爾三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8)加入上述混合物中，溫度升至37℃，將混合物靜置15分鐘。再加入10毫升添加了蔗糖(最終濃度為10(重量/體積)%)和氯化鎂(最終濃度為10毫升摩爾)的DME培養(yǎng)基。得到的混合物可在37℃下靜置10分鐘。
(2)原生質(zhì)體與骨髓瘤細(xì)胞的融合(轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制備)將骨髓瘤細(xì)胞(1×107細(xì)胞;X63-Ag8-6，5，3(HGPRT-))(戴尼邦醫(yī)藥有限公司-流動(dòng)實(shí)驗(yàn)室公司)加到(1)所得到的培養(yǎng)物中?；旌衔镌?500rpm離心機(jī)上離心5分鐘。棄去上清液，將沉淀物攪松，再緩慢地加入0.5毫升聚乙二醇溶液(將磷酸緩沖生理食鹽水(PBS)加到9克PEG400(Sigma)中配制成20毫升)，使沉淀物均勻懸浮。靜置于1分鐘后，在37℃下將DME培養(yǎng)基分8次加入懸浮液，每次1毫升，每次相隔30秒鐘。在整個(gè)混合物經(jīng)離心后，將沉淀物懸浮在含有下述組分的RPMI-XHT培養(yǎng)基中。得到的細(xì)胞懸浮液分配在3塊96-槽平板中，保溫48小時(shí)。
RPMT-XHT培養(yǎng)基組分在RPMI-1640(Gibco;1升)中加入36毫克卡那霉素，120毫克鏈霉素，250毫克黃嘌呤，13.6毫克次黃嘌呤，3.87毫克胸腺嘧啶核苷，3.5微克2-巰基乙醇，2.0克碳酸氫鈉。配制成總?cè)莘e為1升，然后再加100毫升FCS(小牛胎兒血清)。上述培養(yǎng)另加霉酚酸至6毫克/升(RPMI-XHMT)，在其中通過(guò)培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇。培養(yǎng)2周后，完成選擇，在此期間每隔3天用新鮮培養(yǎng)基換去一半培養(yǎng)基。
用磷酸鈣方法將pKSV-10-γ-gpt和pKSV-10-γ-tk引入L(tk-)細(xì)胞中并用以上同一方法分別在RPMI-XHMT培養(yǎng)基和RPMI-HAT培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。
Ⅲ.γ-IFN的表達(dá)用含有下述組分的培養(yǎng)基將pKSV-10-γ-gpt轉(zhuǎn)化骨髓瘤細(xì)胞X63-Ag8-6，5，3(HGPRT-)調(diào)節(jié)至5×104細(xì)胞/毫升。把20毫升懸浮液置于直徑100毫微米的皿中，并在37℃保溫箱內(nèi)培養(yǎng)4天。收集的細(xì)胞置于旋轉(zhuǎn)的瓶?jī)?nèi)，細(xì)胞密度為8×10細(xì)胞/毫升，培養(yǎng)物體積為100毫升，在37℃恒溫室轉(zhuǎn)速為50rpm中培養(yǎng)。
培養(yǎng)基成分在8體積RPMI-1640(Sigma;1升)，1體積DME(Sigma)和1體積F-12(Sigma)的混合物中，溶有25毫摩爾HEPES(Sigma)，4克葡萄糖，2克碳酸氫鈉，3，5微克2-巰基乙醇，36毫克卡那霉素，150毫克鏈霉素，250毫克黃嘌呤，13.6克次黃嘌呤和3.87毫克胸腺嘧啶核苷，配制成總體積為1升。再加入霉酚酸6毫克/升。生成的混合物再加100毫升Nu血清(合作研究)。
第5天起，每天用新鮮培養(yǎng)基置換一半培養(yǎng)基。在保持旋轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞密度為1.0×106～1.5×106/毫升的同時(shí)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。按下述方法，測(cè)定每天回收的培養(yǎng)物上清液。
將Ⅱ中所得轉(zhuǎn)化L細(xì)胞置于60毫米的幾個(gè)園皿中按常規(guī)方法培養(yǎng)，并按下述方法測(cè)定每份上清液。
另外，用0.5毫升姥鮫烷(2，6，10，14-四甲基-十五烷;瓦科純化學(xué)工業(yè)社)對(duì)7周齡Balb/c nu/nu裸鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)接種，一周后再用pKSV-10-γ-gpt轉(zhuǎn)化的1×107骨髓瘤細(xì)胞X63-Ag8-6，5，3(HGPRT-)進(jìn)行腹腔內(nèi)接種。連續(xù)20天喂養(yǎng)后，按下述方法收集和測(cè)定腹水液。
Ⅳ.γ-IFN的測(cè)定用50%細(xì)胞病效應(yīng)(CPE)抑制測(cè)定法，在96-槽微滴定板上按菲利浦等人(酶學(xué)方法，78，389～394，1981)報(bào)告方法，用人體羊膜衍生FL細(xì)胞和Shindbis病毒(SV)與由NIH得到的標(biāo)準(zhǔn)αIFN和由杰奈梯奇(Genentech)得到的γ-IFN共同測(cè)定培養(yǎng)物上清液和腹水液樣品的γ-IFN。
得到的測(cè)定結(jié)果如下。
體外培養(yǎng)載體 宿主 γ-IFN滴定率(單位/毫升)pKSV-10-γ-gpt X63-Ag8-6，5，3 4×105(HGPRT)pKSV-10-γ-gpt L(tk) 3×103pKSV-10-γ-tk L(tk) 3×102在Balb/c nu/nu 小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)pKSV-10-γ-gpt X63-Ag8-6，5，3 7×105(HGPRT-)
在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)連續(xù)20天期間，培養(yǎng)開(kāi)始后第5天起每天回收一半培養(yǎng)基中的產(chǎn)率幾乎保持不變。50毫升培養(yǎng)基/100毫升旋轉(zhuǎn)瓶/天表達(dá)出4×105單位/毫升，這是非常高的產(chǎn)率。據(jù)估計(jì)，用空心絲進(jìn)行的高密度培養(yǎng)可以得到5×107單位/毫升的表達(dá)。因此，本發(fā)明提供了一個(gè)生產(chǎn)肽的極佳方法。
用于代替γ-IFN基因的α-IFN基因的產(chǎn)率在pKSV-10-γ-gpt-L(tk-)和pKSV-10-γ-tk-L(tk-)組合中表達(dá)出得到的滴定率分別為1×104單位/毫升和2×103單位/毫升。
當(dāng)在pKSV-10-γ-gpt和X63-Ag8-6，5，3組合中應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(不加FSC胰島素，而將鐵傳遞蛋白，硒，乙醇胺和牛血清白蛋白(BSA)加入其中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，得到的滴定率為1×106單位/毫升。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生所需肽的方法，包括(1)用具有SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序的載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序位于所需的肽編碼基因的5′末端上行鏈上和3′末端下行鏈上，(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，和(3)純化所需的肽。
2.一種產(chǎn)生所需的肽的方法，包括(1)用具有SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序的載體轉(zhuǎn)化骨髓瘤細(xì)胞，該SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序位于所需的肽編碼基因的5′末端上行鏈上和3′末端下行鏈上，(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)的胞，和(3)純化所需的肽。
3.一種具有SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序的載體，該啟動(dòng)區(qū)順序位于所需的肽編碼基因的5′末端上行鏈上和3′末端下行鏈上。
4.一種用具有SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序的一種載體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該啟動(dòng)區(qū)順序位于所需的肽編碼基因的5′末端上行鏈上和3′末端下行鏈上。
5.一種如在權(quán)利要求
4中所要求專利保護(hù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是一種骨髓瘤細(xì)胞。
6.一種如在權(quán)利要求
2中所要求專利保護(hù)的方法，其中所述骨髓瘤細(xì)胞選自由大鼠骨髓瘤細(xì)胞，小鼠骨髓瘤細(xì)胞和人體骨髓瘤細(xì)胞組成的一組細(xì)胞。
7.一種如在權(quán)利要求
6中所要求專利保護(hù)的方法，其中所述小鼠骨髓瘤細(xì)胞選自由P3-X63-Ag8-U1 HGPRT-，X63-Ag8-6，5，3HGPRT-和SP2/O-Ag14 HGPRT-組成的一組細(xì)胞。
8.一種如在權(quán)利要求
1中所要求專利保護(hù)的方法，其中所述的所需的肽選自由淋巴激活素、激素、抗原蛋白、組織血纖維蛋白溶酶原激活因子和促生長(zhǎng)因子組成的一組肽。
9.一種如在權(quán)利要求
2中所要求專利保護(hù)的方法，其中所述的所需的肽選自由淋巴激活素、激素、抗原蛋白、組織血纖維蛋白溶酶原激活因子和促生長(zhǎng)因子組成的一組肽。
10.一種如在權(quán)利要求
3中所要求專利保護(hù)的方法，其中所述的所需的肽選自由淋巴激活素、激素、抗原蛋白、組織血纖維蛋白溶酶原激活因子和促生長(zhǎng)因子組成的一組肽。
11.一種如在權(quán)利要求
4中所要求專利保護(hù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述的所需的肽選自由淋巴激活素、激素、抗原蛋白、組織血纖維蛋白溶酶原激活因子和促生長(zhǎng)因子組成的一組肽。
專利摘要
一種用轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞和培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)所需的肽的方法可以通過(guò)用骨髓瘤細(xì)胞作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或用具有SV40早期啟動(dòng)區(qū)順序的載體予以改進(jìn)，該啟動(dòng)區(qū)順序位于所需的肽編碼基因的5′末端上行鏈上和3′末端下行鏈上。
文檔編號(hào)C12N15/00GK87102823SQ87102823
公開(kāi)日1987年11月4日 申請(qǐng)日期1987年4月14日
發(fā)明者村上賢司, 殿岡康昭, 齊藤德江, 中筋公吉, 杉山則文 申請(qǐng)人:第一制藥株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan