專利名稱：：一種超分子結構的血液相容性物質的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種血液相容性的超分子物質，尤其是涉及一種能抑制血小板代謝的超分子結構的血液相容性物質。用來與血液相接觸的醫療儀器(如人造器官、體外血液循環線路和血袋)需要具有非常可靠的血液相容性。通常，這類醫療儀器由諸如聚丙烯和聚乙烯這樣的以聚烯烴為主的樹脂制成，這是因為這類樹脂具有高機械強度且容易成形。然而，制造醫療儀器的常用聚合物質并不具有血液相容性。因此常用的醫療儀器必須與一種抗血液的促凝劑一同使用。但考慮到它對人體或血液可能產生的不利影響，抗-血液的促凝劑的持續使用時間受到限制。因此，從時間方面來看，采用這類常用醫療儀器的治療是極有限的。基于這些因素，為了找到一種具有極好的血液相容性的物質，目前已進行了許多研究。作為其一個典型的實例，方法是將一種抗血栓劑(諸如肝素)固定在用來與血液相接觸的醫療儀器上。然而，這類方法需要將抗血栓劑固定在每一個醫療儀器上，因此，例如，由于抗血栓劑的脫落，失效的同時還會出現抗血栓劑的性能下降的缺陷。因此，本發明的一個目的是提供一種血液相容性物質，這種物質不需要對表面進行改變，且其本身具有極好的相容性。本發明是通過一種抑制血小板代謝的超分子結構的血液相容性物質而達到上述目的的，這種物質含有許多環狀化合物和穿入環狀化合物空隙中的親水直鏈聚合物，其中直鏈聚合物的兩端分別由大量足以防止環狀化合物脫離的生物降解基團進行封端。本發明的另一個目的和優點將在下面的說明書中闡述，且部分從說明書中是顯而易見的，或者可從本發明的實驗而知。本發明的目的和優點可以通過上文特指的方法和結合獲知。引入并構成說明書一部分并對本發明的優選實施方式進行說明的附圖，與上述一般性描述和下述的優選實施方式的詳細說明一同對本發明的實質進行闡述。圖1為用圖解方式表示本發明血液相容性物質的示圖；圖2是根據凝血酶誘導的細胞漿游離鈣的增加以及對比例來說明本發明血液相容性物質的抑制作用的圖形；圖3是說明DPH熒光偏振的各向異性的圖；且圖4是根據膜流動性來說明本發明的血液相容性物質的作用的圖形。本發明不是從血液相容性物質的常用構圖得以實現，而是根據找到了一種能抑制血小板代謝的超分子結構的polyrotaxanes來實現，這種polyrotaxanes中有一種穿入許多環狀化合物中的直鏈聚合物。近來，在超分子化學領域里非常盛行研究具有穿入許多環狀化合物中的高分子鏈的結構的polyrotaxanes。例如，日本專利申請KOKAINo.8-92130公開說明書公開了一種超分子結構的生物降解的藥物聚合物聚集體，它包括許多由藥物與環糊精結合而制備的藥物結合型環狀化合物，以及穿入這些環狀化合物空隙的直鏈聚合物。本發明的發明人已發現某些類型的polyrotaxanes可抑制血小板代謝，且因此這類polyrotaxanes本身具有極好的血液相容性。根據這一發現，他們已完成了本發明。用于本發明的環狀化合物可優選由以下物質組成的組α-環糊精，β-環糊精，γ-環糊精及其混合物。其中，特別優選α-環糊精。在本發明中，穿入環狀化合物空隙的直鏈親水聚合物具有生物相容性，且其優選的實例為聚乙二醇(有時稱作PEG)以及聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。優選這些直鏈親水聚合物具有的數均分子量為200-10,000，更優選為400-5,000。優選聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物應含有10-90mole％的聚乙二醇，更優選為30-60mole％。如果這些直鏈親水聚合物從開始在兩端具有大量基團，那么這種聚合物就不會穿入環狀化合物的空隙。因此，應將兩端具有甲基，甲氧基和氨基這類小基團的那些聚合物(不能阻止親水聚合物穿入環狀化合物)用于首先穿入環狀化合物的空隙中。通過一種簡單的方法可將親水聚合物穿入環狀化合物的空隙中，即向一種飽和的環狀化合物水溶液中滴加親水聚合物的水溶液，隨后攪拌。使用這種方法，可以得到沉淀型的一種超分子結構(polyrotaxanes)，其中親水聚合物穿入到環狀化合物的空隙中。得到直鏈親水聚合物穿入許多環狀化合物空隙中的polyrotaxanes后，將直鏈聚合物的兩端分別用足以防止環狀化合物脫離的大量生物降解基團進行封端。優選生物降解基團由一種寡肽鏈或一種寡糖鏈組成，寡肽鏈的單位為一種氨基酸，諸如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸(thyrosin)，半胱氨酸(cystein)，賴氨酸，精氨酸，或組氨酸，寡糖鏈的構成單位是一種糖，諸如糊精，透明質酸，殼多糖，脫乙酰殼多糖，精氨酸(arginicacid)，硫酸軟骨素，淀粉或粘稠性多糖。每個寡肽鏈和寡糖鏈應優選包含1-5個構成單位，且此單位可以是同一類型，或不同類型。可以通過本領域已知的方法如酯基轉移作用來引入這些生物降解基團。對于由穿入環糊精空隙的直鏈親水聚合物組成的超分子結構血液相容性物質來說，已發現當將環糊精被羥丙基化時，這類物質具有非常有效的血液相容性。這種超分子結構血液相容性物質(即在下述實施例中合成的HP-α/E-PHE)的結構用圖解法示于圖1。從圖1可見，這種超分子結構由許多α-環糊精和穿入α-環糊精空隙中的聚乙二醇組成，其中將苯丙氨酸引入并結合在聚乙二醇的兩端。由于羥丙基化作用，每個α-環糊精均含有羥丙基基團。優選每個諸如α-環糊精這樣的環糊精分子中含有2-16個、更優選6-9個羥丙基。本發明的血液相容性物質具有polyrotaxanes結構(超分子結構)，其中直鏈親水聚合物穿入許多環狀化合物(α-環糊精等)中，因此這種物質能增強用來與這種物質相接觸的血細胞的膜流動性。而且，與此相關的是，這種物質可抑制細胞漿游離鈣濃度的升高，并調節血細胞中的細胞內代謝，這取決于鈣的濃度。親水聚合物兩端的生物降解基團由一種酶分解，因而同時釋放出由聚合物穿入的所有環狀化合物，且將它們在體內吸收并排泄。實施例<血液相容性物質的合成>向飽和的α-環糊精(α-CD)水溶液中分別逐滴加入具有聚乙二醇數均分子量Mn為2000的α-[(2-氨基-2-乙基甲基)-X-丙氧基]-w-(氨基-y-丙氧基)聚乙二醇(x+y＝2.5)(在下文稱“PEG-BA2000”，由SuntechnoChemicalCo.，Tokyo，Japan提供，如JEFFAMINEED-2001)和具有Mn為4000的α-(3-氨丙基)-w-(3-氨丙基)聚乙二醇(下文稱“PEG-BA4000”，由SanyoChemicalCo.，Ltd.，Kyoto，Japan提供，如IONETYB-400)的10wt％水溶液，并分別攪拌以得到白色沉淀(Polyrotaxanes)。通過如下所述的酯基轉移作用將每個PEG兩端的氨基用L-苯丙氨酸(L-Phe)進行封端。將芐氧基羰基(縮寫為Z)-L-Phe(由WakoPureChemicalCo.Ltd提供)溶解在干燥的二甲基亞砜(DMSO)，隨后分別加入相應的polyrotaxanes。然后，將DMSO加入所得懸浮液中直至均勻，并在室溫下攪拌48小時。在室溫下，將所得的兩端用Z-L-Phe(分別為α/E2-PHE-Z和α/E4-PHE-Z；其中E2代表具有PEG的Mn為2000的polyrotaxanes，E4代表Mn為4000的polyrotaxanesPEG)封端的polyrotaxanes與氧化丙烯在1NNaOH水溶液中反應24小時。用HCl水溶液中和后，將所得溶液對水進行滲析，再將所得產物進行冷干。這樣便得到終端為Z-L-Phe的羥丙基化的polyrotaxanes。最后，在氫氣氛中用鈀-碳將每個以Z-L-Phe終止的polyrotaxanes的Z-基團去除，從而得到羥丙基化的polyrotaxanes(HP-α/E2-PHE和HP-α/E4-PHE)。(當它們合稱時，在下文將使用總的名稱HP-α/E-PHE。)用1H-NMR測定HP-α/E2-PHE和HP-α/E4-PHE中的α-CDs的數量分別約為11和22。用1H-NMR還測出在HP-α/E2-PHE和HP-α/E4-PHE二者中的羥丙基化的程度(即每個α-CD的羥丙基的數量)為每個α-CD有8個羥丙基。作為參考樣品，如下制備羥丙基化的α-CD(HP-α-CD)和以L-Phe終止的PEGs(E2-PHE和E4-PHE，下文中有時將它們一同稱作“E-PHE”)(1)用HP-α/E-PHEs中相同的方法使α-CD羥丙基化而得到HP-α-CD。用1H-NMR測得羥丙基化的程度為8/α-CD。(2)在DMF中通過將Z-L-Phe-琥珀酰亞胺分別與PEG-BA2000和PEG-BA4000反應來合成E2-PHE和E4-PHE。將反應混合物注入過量的干燥乙醚中，然后用乙醚洗滌以得到E2-PHE和E4-PHE。<用靜態光散射(SLS)測定法測定polyrotaxanes的特性>使用裝備有10mWHe-Ne激光(具有的波長為633nm)的一種光散射儀器(OtsukaElectronics，Co.，Dsaka，Japan，DLS-7000)，通過SLS測定法測定HP-α/E-PHEs的重均分子量(Mw)，締合數，第二維里系數(A2)轉動半徑(Rg)。更為特別的是，在37℃下將0.2gHP-α/E-PHE溶解在10mlPH為7.4的0.05M磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并攪拌48小時。通過孔徑大小為0.45m的過濾器將所得溶液過濾，并制備出0.5-8.0mg/ml的稀釋樣品。將這些樣品溶液通過孔徑大小為0.2μm的過濾器轉移至光散射池中。在37±0.5℃下、30-15°的角度范圍內進行測定。按照同樣的方法，實驗HP-α-CD和E-PHE的SLS測定法。用雙光束差示折射計(OtsukaElectronics，Co.，Osaka，Japan，DRM-1030)測得37℃時HP-α/E2-PHE和HP-α/E4-PHE溶液的折光指數增值分別為0.16和0.14mg/升(L)。從(Kc/R(θ))對sin2(θ/2)的制圖(齊姆圖)中得到HP-α/E-PHEs和E-PHEs的Mw、A2和Rg值，其中K為已知光學常數的總和，c為濃度，R(θ)為瑞利比。在10-50mg/ml濃度范圍內從(Kc/R(θ))對c的制圖(德拜圖)中得到HP-α-CD的Mw和A2值。應注意在10-50mg/ml濃度范圍內E2-PHE不會完全溶解，且因此僅能測定可溶解在PBS中的部分。而且，通過德拜圖可得到HP-α-CD的Mw和A2值，但不能測定HP-α-CD的Rg值。由所得到的重均分子量和單體的分子量可估算締合數。將SLS測定法的結果概括在下面的表1中。從表1可見，估算的HP-α/E2-PHE和HP-α兩者的締合數約為2，且估算的HP-α/E4-PHE的締合數約為20。此外，估算的E-PHE的締合數約為50。HP-α/E-PHE和HP-α-CD的A2值為2×104-6×104mL·mole/g2，而E-PHE的A2值為0.25×104-0.90×104mL·mole/g2。HP-α/E-PHE及其構成分子的值在64-150nm的范圍內。表1用靜態光散射測定法測定HP-α/E4-PHE等的特性</tables><血小板中細胞漿游離鈣變化的測定>用Yui等在J.Biomater.Sci.Polym.Edn.4199(1993)和J.Biomater.Sci.Polym.Edn.4，199(1993)所述的同樣方法，應用承載有1-(2-(5’-羧基噁唑(oxazol)-2’-偶酰)-6-氨基(amono)苯并呋喃-5-氧)-2-(2’-氨基-5’-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-五乙酸基甲基酯四乙酸酯(Fura2-AM)的血小板懸浮液來測定血小板中的細胞漿游離鈣濃度([Ca2+]i)。從體重為2.5-3.0kg的雄性日本白兔的檸檬酸化血液中制備Ca2+-和Mg2+-游離Hanks’平衡鹽液(HBSS)中的血小板懸浮液(血小板濃度3×108/ml)。用Fura2-AM溶液(濃度為5μM)在37℃時將血小板懸浮液溫育60分鐘而使Fura2-AM裝載在血小板上。用HBSS洗滌血小板，且最終使血小板懸浮在HBSS中，使得最終的血小板濃度為3×108/ml。用CaCl2使血小板懸浮液再鈣化，以便使用在HP-α/E-PHE測定前的表觀鈣濃度為1mM。將100μl10wt.％HBSS中的HP-α/E-PHE溶液與400μl上述承載有Fura2-AM的血小板懸浮液混合，并在37℃下在裝備有磁性攪拌器的熒光計(JapanSpectroscopicCo.，Tokyo，Japan，modelCAF-100)的熒光比色杯中進行攪拌。然后，將凝血酶加入該混合物中。在340和380nm處激發此混合物，在500nm測定發射。將兩波長處的熒光強度用來確定熒光二色性比340/380(R)。用G.Grynkiewicz等在J.Biol.Chem.，260，3440(1985)中報道的同樣方法，根據R值來計算細胞漿游離鈣濃度[Ca2+]i。作為對照，在與溶液混合之前，檢驗未使用血小板中的100-200nM[Ca2+]i。為了使對血小板功能或Fura2-AM泄漏的時間依賴性作用降至最低程度，在承載Fura2-AM1小時內應完成這些實驗。按照同樣的方法，計算Polyrotaxanes的構成分子及其混合物的[Ca2+]i。作為結果，當將HP-α/E-PHE溶液加入血小板懸浮液中，可觀察到在Fura2-AM的熒光比方面幾乎沒有改變。這一觀察結果表明HP-α/E-PHEs并不會誘導細胞漿游離鈣濃度[Ca2+]i增加，即HP-α/E-PHEs不會激活血小板。然后，在與HP-α/E-PHE溶液混合后1分鐘，將凝血酶(最終濃度0.1單位/ml)加入血小板懸浮液中。通過加入了HP-α/E2-PHE溶液而使凝血酶誘導的細胞漿游離鈣濃度[Ca2+]i的增加受到顯著抑制(圖2)。而對于參考樣品來說，雖然其它構成分子、HP-α-CD和PEG(E2-OH)并不表現出抑制作用，但HP-α-CD和E2-PHE的混合物(HP-α-CD+E2-PHE)以及E2-PHE對[Ca2+]i的增加表現出較低的抑制作用(圖2)。<血細胞膜流動性的評價>已有報道包括增強的流動性在內的血漿膜的任何物理化學改變可控制膜蛋白的功能和/或某些細胞系統的細胞內代謝(C.H.Bamford等，Biochem.Biophys.Acta，886，109(1986)，和Proc.Natl.Acad.Sci.，76，368(1979))。根據這種觀點，使用載有DPH的紅細胞空胞懸浮液可檢測polyrotaxanes對血漿膜流動性的作用。更為特別的是，收集2.5-2.8kg重的雄性日本白兔的檸檬酸化血液并以1000rpm離心15分鐘，從而得到血紅細胞(RBCs)。用0.155MNaCl溶液(pH7.4)洗滌RBCs，再以1000rpm離心10分鐘，共兩次。用15-20倍體積的0.01MPBS(pH7.4)將該懸浮液洗滌數次。在4℃下以18000rpm離心30分鐘后，根據微BCA法，用0.155MNaCl溶液(pH7.4)以0.1mgprot.mL-1調整所得的RBC空胞懸浮液，這種方法記載在P.K.Smith等的Anal.Biochem.150，76(1985)中。將四氫呋喃中的1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)(WakoPureChemicalCo.Ltd.)溶液(2mM)稀釋入RBC空胞懸浮液中至2μM，并在37℃下的避光處通過緩慢攪拌而溫育60分鐘。為了評價膜流動性而測定RBC空胞中DPH的熒光各向異性。在360nm激發波長處檢測載有DPH的RBC空胞的熒光發射光譜(360-500nm)。在37℃時，在裝有熒光極化附件(JapanSpectroscopicCo.，Tokyo，Japan，ADP-300)的分光熒光計(JapanSpectroscopicCo.，Tokyo，Japan，FP-777)的熒光比色杯中將100μl0.155MNaCl溶液(pH7.4)中的polyrotaxane溶液與400μl載有DPH的RBC空胞懸浮液混合，并進行磁性攪拌。在360nm處激發DPH，并在430nm處檢測到熒光。激發和發射兩者的狹縫寬為10nm。用插入有激發和發射光程的起偏振器測定熒光強度。用下列等式計算熒光各向異型，<r>，<r>＝(IH-IHb)-G(IV-IVb)/(IH-IHb)+2G(IV-IVb))其中IH和IV是通過分析水平的和垂直的起偏振器的極化激發光束而觀察到的發射強度；IHb和IVb為空白溶液(0.155MNaCl溶液)在起偏振器的位置與IH和IV相同時的熒光強度；G是校正因子，等于IV’/IH’，主要含義表示在水平方向極化的激發。按照同樣的方法，測定HP-α/E-PHEs的構成分子及其混合物的<r>。在未使用的RBC空胞中熒光各向異性<r>0約為0.23-0.27，與所報道的<r>0值(C.Sambilla，Neurochem.，38，1699(1982))一致。如圖3所示，通過加入HP-α/E-PHE溶液使<r>立即下降，表明RBC空胞的膜流動性下降。(圖3中，標繪有◇的線表示對照組(0.155MNaCl)，標繪有□的線表示HP-α-CD組，標繪有△的線表示HP-α-CD與E2-PHE的混合物組，標繪有O的線表示HP-α/E2-PHE組)。圖4概括了是加入HP-α/E-PHE溶液后<r>的變化(<r>t-<r>0)，以及加入其構成分子和混合物后的變化。從圖4可見，雖然HP-α-CD+E2-PHE和E2-PHE對膜流動性產生一些作用，但HP-α/E2-PHE導致<r>顯著下降。HP-α-CD和E2-OH對膜流動性沒有影響。在Mn為4000的PEG組(HP-α/E4-PHE)中也可觀察到ployrotaxane的這些特殊現象。從上述結果可知，由ployrotaxane構成的本發明的血液相容性物質能有效地防止或抑制凝血酶誘導的細胞漿游離鈣濃度的增加。特別是如在HP-α/E2-PHE組觀察到的，ployrotaxane的這些作用與其構成分子(如HP-α-CD與以L-Phe終止的PEGs的混合物)相比有較顯著的差異。而且，RBC空胞的增強的膜流動性與本發明血液相容性物質所觀察到的膜流動性相比有極顯著性差異。此外，SLS研究表明由于穿入的HP-α-CDs與終端L-Phe部分的親水-疏水平衡性，而存在特殊的超分子締合的ployrotaxane。這些發現對于由這些ployrotaxane調節血細胞中細胞內代謝是非常重要的。構成本發明血液相容性物質的每個分子對機體都是無害的。用一種酶分解位于親水聚合物終端的生物降解基團，因而將由直鏈親水高分子穿入的所有環狀化合物同時釋放，以便在體內被吸收并排泄。如上所述，根據本發明，提供了能抑制血小板代謝的血液相容性物質，且這種物質本身具有極好的血液相容性。這種血液相容性物質是在體內被分解和吸收而進行代謝的，因而不僅將它用于與血液相接觸的體外醫療儀器，諸如人造器官、血袋和體外血液循環線路，而且還可用于醫療用的體內填補微型機器。對于本領域技術人員來說很容易想到其它的優點和改變。所以，本發明主要方面并不局限于本文所示和所述的特殊的詳圖和有代表性的實施方式。因而，在不脫離由所附的權利要求書和其相同內容而定義的總的發明構思的內容或范圍的前提下，可以進行各種修改。權利要求1.一種抑制血小板代謝的超分子結構的血液相容性物質，其特征在于它含有許多環狀化合物和穿入環狀化合物空隙中的親水直鏈聚合物，其中直鏈聚合物的兩端分別由大量足以防止環狀化合物脫離的生物降解基團進行封端。2.根據權利要求1的血液相容性物質，其特征在于環狀化合物選自由以下物質組成的組α-環糊精，β-環糊精，γ-環糊精及其混合物。3.根據權利要求2的血液相容性物質，其特征在于直鏈聚合物是具有數均分子量為200-10,000的聚乙二醇。4.根據權利要求2的血液相容性物質，其特征在于直鏈聚合物是聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，該共聚物具有的數均分子量為200-10,000，且直鏈聚合物包含10-90mole％的聚乙二醇。5.根據權利要求2的血液相容性物質，其特征在于生物降解基團由一種寡肽鏈或寡糖鏈組成。6.根據權利要求2的血液相容性物質，其特征在于將環糊精羥丙基化。7.一種抑制血小板代謝的具有超分子結構的血液相容性物質，其特征在于它含有許多環狀化合物和穿入許多環狀化合物空隙中的親水直鏈聚合物，其中環狀化合物選自由以下物質組成的組α-環糊精，β-環糊精，γ-環糊精及其混合物，其中直鏈聚合物選自具有數均分子量為200-10,000的聚乙二醇以及聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，所述的共聚物包含10-90mole％的聚乙二醇，該共聚物具有的數均分子量為200-10,000，直鏈聚合物的兩端分別由大量足以防止環狀化合物脫離的生物降解基團進行封端，所述的生物降解基團由一種寡肽鏈或寡糖鏈組成。8.根據權利要求7的血液相容性物質，其特征在于將環糊精羥丙基化。9.根據權利要求8的血液相容性物質，其特征在于每個環糊精分子含有2-16個羥丙基。全文摘要一種抑制血小板代謝的具有超分子結構的血液相容性物質包含許多環狀化合物和穿入環狀化合物空隙中的親水直鏈聚合物。聚合物的兩端分別由大量足以防止環狀化合物脫離的生物降解基團進行封端。文檔編號C08L77/12GK1199739SQ9810972公開日1998年11月25日申請日期1998年5月8日優先權日1997年5月8日發明者由井伸彥,寺野稔,森秀晴申請人:北陸先端科學技術大學院大學長