專利名稱:回收人外周血白細胞的單克隆抗體及其方法
本發明是關于一種鼠的單克隆抗體，這種抗體特別適用于檢測無紅細胞溶解的循環外周血中的白細胞亞型。其次，本發明的目的在于提供一套改進的檢測方法，即利用被該單克隆抗體包裹的適宜單分散微球體來回收人血樣品中的白細胞。
用對細胞或組織的抗原決定族具有特異性的單克隆抗體包被支持物或微球體，通常將這些支持物或微球體用于檢測和診斷。這些都在先有技術中記載了。
為了將所選的細胞群體分類并使之與異源細胞群體分開，磁性粒子或微球體的使用也是眾所周知的。Senyei等人的專利4，230，685，Graver的專利3，970，518，4，018，886和4，115，535，Davis的專利4，177，253，Molday的專利4，452，773，Gerlinski的專利4，454，234和Rernbaum的專利4，267，234都僅為這種技術的一些例子。Smilh等人的4，272，510和Forrest等人的4，141，687講授過用磁性粒子達到檢測目的的儀器。在挪威，奧斯陸的Sintef根據專利合作條約(PCT)提交的公開國際專利申請中也描述了磁性微球體對細胞分離的應用，其PCT申請號為83/00014，1983年4月22日提交，國際公布號為WO83/03920，1983年11月10日公布及PCT申請號為83/00016，1983年4月27日提交，國際公布號為WO84/02031，1984年5月24日公布。然而，申請人不知道單克隆抗體可成功而精確地用于從人的外周血樣中分離白血細胞亞型。
人的循環血是由細胞和液體成分所組成的。細胞成分包括紅細胞(紅血細胞)、血小板和白細胞(白血細胞)1毫升正常全血樣品中含有5×106紅細胞，3×105血小板和5×103白細胞。白血細胞群體又分為5個亞型或群體，稱為中性白細胞，嗜曙紅細胞，嗜堿細胞，單核白細胞和淋巴細胞。在白血細胞數為5×103的人血樣品中，每毫升血含有3，075個中性白細胞，150個嗜曙紅細胞，25個嗜堿細胞，250個單核白細胞和1500個淋巴細胞。淋巴細胞由8種不同的類型組成，表明有幾種功能的種類存在。已知大多數控制人體內抗體產生并為抗體的產生作準備的細胞都是在稱為淋巴細胞的白細胞群體中發現的。此外，經鑒定淋巴細胞亞型的數目很多。
容易看出對血樣中白細胞群體的透徹分析是一個有用的診斷工具。獲得這樣的資料的常規方法包括自動化電子白血細胞分類儀，機械，電子和光散射細胞計數技術。這種昂貴儀器的使用在經濟上受到一定的限制。此外，在無特異的單克隆抗體和特殊技術的情況下，不能用這樣的方法來確定白細胞亞型。這也適用于熒光型技術的應用。某些先有技術也需要紅血細胞的初溶。
還已知紅血細胞(紅細胞)缺少多數細胞器，而只有一個單層膜，即原生質膜。幾乎所有細胞質成分都能通過滲透溶血作用釋放出來，從而提供“血影細胞”，這種血影細胞是相當純的原生質膜。通過已知的染色技術確定紅血細胞膜含有幾種富含碳水化合物的蛋白。此外，已確定這些蛋白是細胞表面蛋白。
紅細胞含有一種跨膜蛋白，經鑒定是血型糖蛋白A，這個蛋白由16個寡糖和一條單肽組成。大約60%的糖蛋白主體是碳水化合物并且這些碳水化合物單位都位于細胞膜的外表面。由于血型糖蛋白A富含碳水化合物，因而使得它能夠很好地著色。蛋白水解的化學修飾和電鏡研究表明血型糖蛋白A具有(1)一個含有所有碳水化合物的氨基末端區，該區位于膜的外表面，(2)一個埋藏在烴中心的疏水中區和(3)一個位于細胞內并構成多肽鏈的羧基末端區。在分子氨基末端部分的碳水化合物單位富含帶負電荷的唾液酸基團。
血型糖蛋白B，也叫糖蛋白δ，是與Ss同種抗原結合的糖蛋白。29位上蛋氨酸或蘇氨酸的存在表明該同種抗原的區別。看來至今只有血型糖蛋白B的氨基末端部分已序列化了。血型糖蛋白C與稱為糖蛋白β和γ的一些成份有關。
構成紅細胞血型糖蛋白的糖蛋白鏈可作為同型和雜二聚體存在，同型和雜二聚體在聚丙烯酰胺電泳(PAGE)之后具有特征帶，應該注意可以進一步根據糖基化和唾液酸化的類型及其程度的不同來描述血型糖蛋白。
申請人:已發展了一種僅對血型糖蛋白A上的一個特異抗原決定簇，即與一個唯一的結合位點結合的單克隆抗體。為了從人的全血樣品中回收白細胞，在磁性分離程序中進行了用抗血型糖蛋白A單克隆抗體包被市售磁性微球體的嘗試。在一例研究中，使用了從加利福尼亞，San Diego的分子生物系統中獲得的蛋白A磁性微球體，其分類號為MMOO2。如美國專利4，230，685所述，這些粒子經過多分散具有0.15-2.0微米的平均大小并發現需要一個表面活性劑。適宜的培養期所需的珠粒與細胞之比和紅細胞減少的百分比證明不能用于商業。此外，還遇到了對白細胞回收的不利干擾。
在一次試驗研究中，利用了從賓夕法尼亞，費城的公爵科研所所獲得的磁性微球體，其分類號為9420A，在這里，這些粒子也經過了多分散，從0.2-0.9微米并且也需要表面活性劑。可以看到這些顆粒的凝集和聚集。白細胞的回收不充分是由于在此過程中隨著紅細胞的減少導致了白細胞的喪失。
申請人:以前對利用這種市售多分散磁性微球體從人的全血樣中分離并回收白細胞的嘗試表明在商業上不能使用這種磁性粒子分離程序。利用這種顆粒基質使本技術商業化而滿足上述普通磁性微球體大量生產的需求是行不通的。然而，現在申請人已能夠進行該方法學的改進，這種改進產生了預想不到的，令人吃驚的成功結果。申請人也已確定了哪種磁性微球體能與其唯一的單克隆抗體一起使用。
本發明闡述了一種由申請人發展起來的鼠的單克隆抗體，這種單克隆抗體選樣性地與暴露在人紅細胞表膜上的血型糖蛋白A的一個決定簇位點相結合。這個單克隆抗體被稱為“KC-16”。與抗血型糖蛋白A結合的特異性使得可通過從血液中分離紅細胞而不需其本身溶溶解的程序，將KC-16單克隆抗體用于人外周血中白細胞的商業可行性檢測。此外，在不改變試驗血樣中白細胞的形態學及無白細胞群體的不利減少情況下得到了分離。
一種特別成功的檢測程序包括在大小分別為1.0和4.5微米的單分散磁性微球體或珠粒上包被KC-16單克隆抗體。在每個例子中，都是將人血樣放在一支試管中，在室溫下培養一段時間，微球體與紅血細胞之比在一例中為7∶1，在另一例中為14∶1，將其引入到試驗容器中。通過在試驗容器的底部應用磁力，把與微球體結合的紅細胞從血樣中分離出來，輕輕倒出剩余的樣品上清液，用注冊商標為EPICS
的佛羅里達，Hialeah Coulter公司的細胞分類儀，通過光散射技術進行分析。
隨著白血細胞的回收紅血細胞成功地減少。紅血細胞減少的百分數為99.5%-99.99%，剩余的白細胞群體為97%-98%。5-30分鐘的培養期就獲得了這些結果。為了顯出一個無孔聚合表面選樣了所用的磁性微球體，這種磁性微球體無表面活性劑。其特性為球形，單分散的并且磁性材料的均勻度是合乎要求的。
為了從人的外周血樣中分離紅細胞，然后用電子血細胞計數和分類技術檢測白細胞群體也可將KC-16單克隆抗體連接到具有合適特征的非磁性微球體上，這種電子白細胞計數和分類技術是在一臺COULTER COUNTER
型儀器上實現的，該儀器是由佛羅里達，Hialeah的Coulter電器公司，即本專利申請代理人所擁有的附屬機構銷售的。KC-16單克隆抗體的獨特的專一性使得借助于體外診斷儀器的使用，采用商業上可行的檢測技術成為可能。
本發明提供能選擇性地與暴露在紅細胞表膜上的血型糖蛋白A的一個特異抗原決定簇結合的鼠的單克隆抗體。對血型糖蛋白A有此特異性的所有單克隆抗體都可稱為“KC-16”。
一種能夠產生KC-16單克隆抗體的雜交細胞或雜交瘤的具體制備方法如下取肺腺癌活體的完整細胞給Balb/c鼠注射，用這種鼠的脾細胞與鼠的漿細胞瘤細胞系，Sp210-Ag14融合;從而產生雜交瘤。每隔兩周給鼠注射3次，在最后一次注射后四天將鼠處死。按照Kohler和Milstein的程序(自然256∶495-497，1975)進行細胞融合。
在此融合過程中，在30%的聚乙烯乙二醇(PEG)和Dulbecco改良Eagles′培養液(DMEM)中將7×107個脾細胞與3.6×107個骨髓瘤細胞融合。細胞融合后，將細胞分布到大約1000個小容器中并在含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的選樣性培養基(HAT)中進行培養。在倒置顯微鏡下定期觀察這些容器中細胞的生長情況。然后收集有細胞生長的上清液，用Elisa技術對產生鼠免疫球蛋白的上清液進行初步篩選。再通過間接免疫過氧化酶染色，用肺腺瘤和正常肺的冰凍和石蠟包埋組織切片篩選來自那些對鼠免疫球蛋白顯陽性細胞集落的上清液。
含有KC-16集落的上清液表明對紅細胞的特異反應性而其它組織成分不著色。為了保證得到專一的克隆，KC-16，將這種集落在軟瓊脂糖中再克隆兩次。由克隆所產生的KC-16抗體通過雙重免疫擴散確定是一種鼠免疫球蛋白lgG1。利用人的細胞類型，即O-陰性，O-陽性，A-陽性，A-陰性，B-陽性，B-陰性，AB-陽性和AB-陰性血型進行了另外的篩選。
能夠產生KC-16單克隆抗體的雜交細胞系樣品貯存在美國典型培養物保藏所，指定號碼為CRL8994。
KC-16單克隆抗體也可用下列程序通過免疫鼠腹水液的親和純化來獲得。在37℃水浴中使冰凍腹水液融化并除去凝塊。將肝素加到融化的腹水液中使腹水液的終濃度達到2mg/ml并在25℃下混合30分鐘。然后加入氯化鎂溶液(1.5M)使濃度為每毫升腹水液含0.0344毫升氯化鎂溶液并在25℃下混合30分鐘。生成液在15℃下，以105G超速離心30分鐘分出上清液，然后用PH為9.0并由1M甘氨酸和4M氯化鈉組成的結合緩沖液以1∶1體積比進行稀釋。用結合緩沖液平衡載體上的蛋白A-瓊脂糖，以此來制備親和柱。把用緩沖液稀釋的上清液傾注到柱上，比例為1ml上清液與1/2ml懸浮在3×CSA中的蛋白A-瓊脂糖。用結合緩沖液把柱子洗到它的基線，用0.1M醋酸鉀(PH6.0)從柱上將KC-16抗體作為第一個峰洗脫下來。將洗脫下來的KC-16抗體濃縮并對0.1%磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)透析。
由于KC-16單克隆抗體選樣性地與暴露在紅細胞表膜上的一個特異血型糖蛋白A抗原決定族結合，而不與白細胞結合，所以可從人的全血樣品中將紅細胞和白細胞群體分開，在一種完成這樣的血細胞分離的方法中，KC-16單克隆抗體可包在合適的磁性微球體上，然后將這種磁性微球體引入全血樣品中;借助于KC-16單克隆抗體，使微球體選樣性地與紅細胞結合，這些紅細胞可通過將一個磁場加到微球體-血液混合物中與白細胞分開。在不使紅細胞溶解，不改變適于進一步檢測和分析的白細胞的形態學和不因結塊或其它原因而使白血細胞相反減少的情況下完成最終的分離。
通常是單分散的或直徑分別為4.5和1.0微米的均勻的無孔磁性微球體(有時稱為“珠粒”)通過預先用兔子或山羊的抗鼠免疫球蛋白(RAM或GAM)包被微球體(珠粒)而使KC-16單克隆抗體很好地結合在它上面。操作如下將250mg珠粒分散在3ml蒸餾水中并進行2-3分鐘聲波處理。在4℃下使水中珠粒的混合物冷卻幾小時。然后將珠粒進行磁化分離并棄去水。再將珠粒重新懸浮在5mgRAM中并用500ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋;將此混合物在室溫下培養并徹底混合4-5小時。此后，用4mlPBS-1%BSA混合物將珠粒洗滌6次。然后在4mlPBS-1%BSA中重新懸浮這些珠粒并徹底混合，在24小時內更換3次PBS-1%BSA。
將5×10g的懸浮珠粒吸量到一支硅化試管中。從棄去的液體中將珠粒磁化分離出來。然后將珠粒重新懸浮在PBS中并將KC-16單克隆抗體加到此溶液中，使最終濃度達0.5mg/ml;然后將此溶液在室溫下邊混合邊培養1小時。然后用PBS-1%BSA將珠粒洗滌6次并重新懸浮在1mlPBS-1%BSA中。
用KC-16包被的磁性微球體使全血中的紅細胞(RBCs)與白細胞(WBCs)分離是通過將微球體與10-100μl的一系列全血樣品混合制備微球體與紅細胞的比例為7∶1-20∶1的混合物來實現的。將微球體與全血的混合物在各自的試管中于室溫下邊輕輕混合邊培養2分鐘。將這些試管放在一個磁場中，從而使在試管底部與磁性中心球結合的紅細胞分離，白細胞則隨著上清液一起被輕輕倒出，用注冊商標為EPICS
的，佛羅里達，Hialeah的Coulter公司的細胞分類儀通過光散射技術分析上清液。這些分離的結果列在表Ⅰ中，表Ⅰ表明10∶1-20∶1的微球體與紅細胞或細胞比例使得全血樣品中的紅細胞可減少99.99%。
表Ⅰ微球體與紅細胞的比例比例 RBCs減少的百分比 WBCs剩余的百分比7∶1 99.21 9010∶1 99.99 73.614∶1 99.99 61.220∶1 99∶99 78.4
在第二次分離過程中，將來自6個不同供體的7個全血樣品與KC-16包被的微球體在每個混合物中以14∶1的相同的微球體與細胞的比例混合。1分鐘后，傾出第一部分上清液，再過1分鐘，傾出第二部分上清液;用EPICS
儀測定在兩次上清液中紅細胞減少的百分比和殘存白細胞的百分比并顯示在表Ⅱ中。表Ⅱ表明在兩次連續的一分鐘培養后使紅細胞平均減少了99.97+0.02%。
表Ⅱ用KC-16標記的4.5微米的磁性微球體進行兩次連續的一分鐘培養在微球體與紅細胞的比為14∶1時紅細胞的減少第一部分上清液 第二部分上清液RBCS 減少的 殘存WBCs的 RBCS減少的 白細胞的百分比 百分比 百分比 百分比99.79 78.6 99.95 71.499.95 96.6 99.98 90.999.94 100 99.99 10099.80 100 99.94 10099.85 100 99.95 10099.94 100 99.99 94.899.97 100 99.98 94.899.89.08 96.5 8.0 99.97.02 93.10.0申請人確定是實用的并使用的磁性微球體有兩個來源。所用珠粒的一個例子是在上文所提到的Sintef的專利申請中描述的。所用珠粒的另一個例子是由賓夕法尼亞。費城的公爵科研所出售的并經鑒定為1.0微米的膠乳-丙烯酰胺。
我們認為KC-16單克隆抗體的獨特專一性使它適用于其它非磁性的支持物或珠粒。在這種應用中，將KC-16單克隆抗體包被在聚合性的，即一種大小均勻的合適的合成塑料制成的支持物或珠粒上。在紅細胞與KC-16包被的支持物結合后，使血樣的上清液通過一個金屬網，珠粒被網眼擋住，而上清液則通過網眼，從而達到分離的目的。然后可進行白血細胞的檢測。
已知血型糖蛋白A是紅細胞膜的主要唾液酸化糖蛋白成分。我們認為糖蛋白A分子的抗原決定簇或抗原位點是一個特異的碳水化合物組分，我們的KC-16單克隆抗體選樣性地與之結合，獲得了如上所述的令人滿意的結果。
本領域專業人員可能想到的顯而易見的修飾都在本發明的范圍之內。
權利要求
1.一種雜交細胞系，該細胞系可產生一種與暴露在人紅細胞表膜上的血型糖蛋白A蛋白質的一個特異抗原決定簇結合的單克隆抗體。
2.權利要求
1所述的細胞系，其中所說的產生抗體的細胞是鼠的脾細胞。
3.權利要求
1所述的細胞系，其中所說的細胞來自于對人的癌細胞有免疫力的鼠。
4.權利要求
2所述的細胞系，其中產生抗體的細胞來自于Balb/c鼠。
5.一種具有貯存在美國典型培養物貯藏所的CRL8994號樣品性狀的雜交細胞系。
6.對暴露在人紅血細胞膜表面上的血型糖蛋白A的一個抗原決定簇有特異性的單克隆抗體。
7.權利要求
6的單克隆抗體，它是通過具有美國典型培養物保藏所的CRL8994號貯存物特征的雜交細胞系產生的。
8.一種在不使血樣的紅細胞群體溶解時檢測人外周血樣中白細胞群體的方法，該方法包括(1)將一些包有權利要求
7的單克隆抗體的充分單分散的微球體引入到所述的血樣中，使微球體與細胞在樣品中達到一個所需的比例;(2)使被包裹的微球體與所述的血樣充分接觸一段時間，從而使所有紅細胞都與單克隆抗體涂包層充分結合而不使白細胞群體減少到不利的程度;(3)從剩余的血樣中分離與抗體結合的微球體;(4)檢測回收血樣中的白細胞群體。
9.權利要求
8所述的方法，其中微球體是有磁性的，從剩余的血樣中分離與抗體結合的微球體是通過在容器的外面接近微球體處加一個磁場而使微球體形成一個凝集物來實現的。
10.權利要求
8所述的方法，其中微球體是非磁性的聚合支持物，從剩余的血樣中分離與抗體結合的微球體是借助于一個機械的網或篩子，其孔徑大小當倒出樣品時可將所述的微球體截住。
11.權利要求
9所述的方法，其中所說的微球體直徑都是4.5微米。
12.權利要求
9所述的方法，其中引入到血樣中的微球體與紅細胞之比在大約7∶1到20∶1的范圍之內。
13.權利要求
12所述的方法，其中所說的比例約為14∶1。
14.權利要求
12所述的方法，其中所說的比例約為7∶1。
15.權利要求
9所述的方法，其中所說的微球體的直徑都為1.0微米。
專利摘要
一種鼠的單克隆抗體，它與暴露在紅細胞膜上的血型糖蛋白A的決定簇位點或特異抗原決定簇選樣性地結合而不與其它血型糖蛋白結合。將這種單克隆抗體包被在一個微球體或一個合適的單分散種類的基質上并在無紅細胞溶解時回收白細胞亞型的分離程序中利用這種單克隆抗體。在樣品的白血細胞群體不相反減少時回收被結合的微環體。所用的微球體或珠粒與細胞之比使本發明非常適用于商業。因此本發明使得不需紅細胞溶解就能精確檢測循環外周血中的白細胞亞型。
文檔編號C07K16/00GK86107203SQ86107203
公開日1987年9月30日 申請日期1986年10月14日
發明者肯尼思·H·科特里特, 戴維德·E·霍夫海茵茨 申請人:科特公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan