專利名稱:發(fā)酵罐的制作方法
本發(fā)明涉及一種容納被攪動的細胞懸浮培養(yǎng)物的連續(xù)發(fā)酵罐容器。
細胞體外發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)品的商業(yè)化的最新進展使得對發(fā)酵罐的設(shè)計和發(fā)酵方法的改進有愈來愈大的興趣。
發(fā)酵通常以分批或連續(xù)的方式進行，連續(xù)生產(chǎn)是有利的，因為它提高了給定發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，並減少了在分批發(fā)酵罐中通常必要的清潔和消毒所必須的非生產(chǎn)停工時間。
在一些已知的連續(xù)發(fā)酵罐容器中，要攪動在適當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)中的細胞懸浮液，并將它維持在適于發(fā)酵的溫度上。連續(xù)地從發(fā)酵罐中抽取懸浮培養(yǎng)物，並通過不斷地輸送新的培養(yǎng)介質(zhì)來平衡。這樣一些發(fā)酵罐的一個重要缺點是由于培養(yǎng)物的排放，會引起細胞不斷的損失。在一種已知的發(fā)酵罐中，排放懸浮培養(yǎng)物要通過一個從培養(yǎng)物上清液中分離出細胞的連續(xù)離心分離裝置，然后將細胞送回到懸浮培養(yǎng)物中。
在另一種已知的發(fā)酵罐中，有一個由過濾材料制成的旋轉(zhuǎn)筐子，它部分地浸在培養(yǎng)物中，使得筐子的內(nèi)部通過該過濾器與懸浮的培養(yǎng)物分隔開。培養(yǎng)物的上清液通過該過濾器可以被連續(xù)地抽取，而把細胞保持在懸浮培養(yǎng)物中?？鹱釉趹腋∨囵B(yǎng)物中的旋轉(zhuǎn)減少了過濾材料的堵塞。
這些已知的使得細胞連續(xù)送回到懸浮培養(yǎng)物中的裝置在機械上很復(fù)雜，它們的運行需要能量，並可能對懸浮培養(yǎng)物造成諸如細胞破裂這樣的不利影響。這些特點結(jié)合在一起，就降低了基于這些發(fā)酵罐的發(fā)酵方法經(jīng)濟上的可行性。
本發(fā)明的目的是要提供一個基本上克服了這些缺點的連續(xù)發(fā)酵罐容器。按照本發(fā)明，提供了一種容納細胞懸浮培養(yǎng)物的連續(xù)發(fā)酵容器。這種容器具有用于攪動裝在該容器第一部分的懸浮培養(yǎng)的裝置;在使用時形成靜止沉降區(qū)的該容器的第二部分，至少它底部的一部分與第一部分相連通;將培養(yǎng)介質(zhì)連續(xù)地輸送到該容器中去的一個入口裝置;以及從第二部分底部上面隔開一定距離的地方將培養(yǎng)物上清液從容器的第二部分連續(xù)地抽取出來的一個出口。使用時，沉降在第二部分中的細胞被送回到被攪動的懸浮培養(yǎng)物中，而具有較低細胞濃度的培養(yǎng)物上清液從第二部分中被抽出。
在本發(fā)明的發(fā)酵罐中，細胞的分離和細胞的回饋步驟是通過一個靜止沉降區(qū)構(gòu)造來完成的，進入到靜止沉降區(qū)的懸浮培養(yǎng)物(補充從靜止沉降區(qū)取走的培養(yǎng)物上清液)從被攪拌的懸浮培養(yǎng)物進入到低擾動的區(qū)域。在這一區(qū)域里，細胞在重力影響下開始向下沉降，並在靜止沉降區(qū)的底部回到攪動的懸浮培養(yǎng)物中。這種沉降在靜止沉降區(qū)中引起一個細胞濃度的梯度，允許從靜止的沉降區(qū)底部上方一定距離的地方將培養(yǎng)物上清液取出，該地方的培養(yǎng)物上清液具有比攪動的懸浮培養(yǎng)物低得多的細胞濃度。本發(fā)明發(fā)酵罐的細胞分離和回饋的部件沒有運動的部分，也不需要外加的能量。
靜止沉降區(qū)可以位于發(fā)酵罐中的任何地方或者可以構(gòu)成使用時盛有被攪動懸浮培養(yǎng)物的容器部分的一個附件。但是，為了使靜止沉降區(qū)中的運動減至最小，最好靜止沉降區(qū)整個處于使用時裝有被攪動懸浮培養(yǎng)物的發(fā)酵罐部分內(nèi)，這就大大地降低了在靜止沉降區(qū)中可能使不良對流增加的溫度梯度。
攪動該懸浮培養(yǎng)物的裝置可以是保證細胞混合的任何一種適當(dāng)?shù)难b置。例如，這種合適的裝置是例如機械攪拌器。但是，在本發(fā)明的一個最佳形式中，是通過一個氣體入口注入氣體，最好是空氣來產(chǎn)生攪動。發(fā)酵罐例如可以是一個“空氣提升”式發(fā)酵罐，在這種發(fā)酵罐里，像空氣這樣的氣體被注入到發(fā)酵罐一個向上延伸的、在已有技術(shù)中被稱為提升通道的部分，該提升通道在其頂部和底部分別與發(fā)酵罐另一個在已有技術(shù)中被稱為下降通道的朝上延伸部分的頂部和底部相連通。空氣提升式發(fā)酵罐一個已知的結(jié)構(gòu)包括有一個在發(fā)酵罐容器中將容器分隔成兩部分(提升通道和下降通道)的中間隔離器?？諝馓嵘桨l(fā)酵罐的另一個可供選擇的結(jié)構(gòu)包括有一個基本上與發(fā)酵罐容器同心的通風(fēng)管，將發(fā)酵罐分成提升通道(在通風(fēng)管內(nèi))和下降通道(通風(fēng)管與發(fā)酵罐側(cè)面之間的環(huán)形空間)。(提升通道同樣也可以是通風(fēng)管和發(fā)酵罐容器內(nèi)側(cè)之間的環(huán)形空間，而下降通道可以是在通風(fēng)管內(nèi))。將空氣這樣的氣體注入到提升通道的下部，引起提升通道中堆密度的下降，使提升通道中的液體向上流動，于是取代了下降通道循環(huán)回到提升通道底部的內(nèi)容。以這樣一種方式，使流體流動，混合培養(yǎng)物、並使細胞保持在懸浮液中。這樣一種發(fā)酵罐的優(yōu)點是不需要運動的部件，並產(chǎn)生培養(yǎng)物的氧合作用。在典型的情況下，提升通道的橫截面與下降通道的橫截面大體是一樣的。
在本發(fā)明一個最佳的實施例中，連續(xù)發(fā)酵罐容器是一個空氣提升式發(fā)酵罐，靜止沉降區(qū)由一個在下降通道和提升通道之間的隔離器所形成一個管道組成，這樣，通過由具有均勻溫度、混合很好的懸浮培養(yǎng)物包圍住這種靜止沉降而防止了不良對流。使用時，發(fā)酵罐中工作液體的液位最好使該沉降區(qū)的頂部被0.25到0.1倍發(fā)酵罐直徑深的工作液體復(fù)蓋住。
隔離器例如可以是一個大體上同心地放在基本上是園柱形發(fā)酵罐容器中的基本上是園柱形的通風(fēng)管，靜止沉降區(qū)可以包括一個至少在通風(fēng)管一部分內(nèi)外壁之間形成的環(huán)形空間。靜止沉降區(qū)在頂部最好是封閉的，並在底部與下降通道相通。在小容量、例如小于10升的空氣提升式發(fā)酵罐中，通風(fēng)管在沿其長度方向上可以是雙壁的，形成一個頂部封閉、底部與懸浮培養(yǎng)物相通的環(huán)形沉降區(qū)，或者、特別是對更大的發(fā)酵罐，靜止沉降區(qū)可以由一個僅僅在通風(fēng)管上部內(nèi)外壁之間的環(huán)形空間組成，在大發(fā)酵罐中，靜止沉降區(qū)必須有足夠大的橫截面積、使得向上流動的流體速度小于細胞的沉降速度以達到良好的細胞分離作用。為了既能容納靜止沉降區(qū)所需要的橫截面積、仍能提供圍繞該容器循環(huán)的足夠橫截面積，發(fā)酵罐的上段可以上具有比下段更大的直徑，提升通道和下降通道在上段的橫截面積基本上是一樣的，並可以分別是發(fā)酵罐底段的提升通道和下降通道橫截面積的0.5至1.0倍之間。為了達到這一點，在上段中同心通風(fēng)管的內(nèi)徑相對于通風(fēng)管下部可以減小，發(fā)酵罐上下段可以用一個對發(fā)酵主軸具有0°到60°角的錐臺段連接起來。
隔離器可以采取通風(fēng)板的形式，由安裝在容器中的基本上垂直的板組成。靜止沉降區(qū)是由在該板上部或沿其長度方向上形成的一個管道組成。
連續(xù)發(fā)酵罐可以用已知的連續(xù)輸送培養(yǎng)介質(zhì)和連續(xù)抽取培養(yǎng)物上清液的方式工作。連續(xù)發(fā)酵罐可以在0.02小時-1到0.08小時-1，最好是0.042小時-1左右的稀釋率(即流率與發(fā)酵罐容積的比值)下運行。
這種發(fā)酵罐可以用于任何能在體外、在懸浮體培養(yǎng)物(包括微載體培養(yǎng)物)中生長的細胞的培養(yǎng)，但是對于例如象雜交細胞體系這樣的動物細胞培養(yǎng)物特別有用。
已經(jīng)確定，動物細胞在重力下將以0.9×10-5毫秒-1到4.0×10-5毫秒-1、通常是1.8×10-5毫秒-1左右的速率沉降。因此，為了在高的連續(xù)生產(chǎn)量和小尺寸的靜止沉降區(qū)取得合理的平衡，每立方米的發(fā)酵罐容積最好有0.1到1.5米2的靜止沉降區(qū)的橫截面積。通常，每立方米發(fā)酵罐容積采用0.65米2的橫截面積。
培養(yǎng)物中的動物細胞會顯示出各種不同的粒子大小，代表了完全生長的細胞、完全死掉的細胞和細胞碎片之間的差別，因而會以各種速率進行沉降。為了提高在沉降區(qū)內(nèi)總的沉降速度，可以絮凝狀態(tài)來培養(yǎng)細胞，例如在培養(yǎng)介質(zhì)中增加0.01到0.3%(W/V)之間的聚半乳糖醛酸來獲得絮凝狀態(tài)。這種處理引起細胞和細胞碎片聚集成具有比單個細胞粒子更大的總顆粒尺寸的絮片，結(jié)果使沉降速度加快。這種現(xiàn)象能使沉降區(qū)的橫截面積降低，因而能使發(fā)酵罐上段的直徑也降低。
本發(fā)明將通過以下參照示意附圖的說明來進一步說明，在附圖中圖1是包括了一個中間隔離板的本發(fā)明空氣提升式發(fā)酵罐的軸向剖面圖。
圖2是包括了一個與發(fā)酵罐容器同心的通風(fēng)管的本發(fā)明空氣提升式發(fā)酵罐的軸向剖面圖。
圖3是包括了一個雙壁同心通風(fēng)管的本發(fā)明空氣提升式發(fā)酵罐的軸向剖面圖。
圖1顯示了一個裝配有將培養(yǎng)物上清液從懸浮培養(yǎng)物中分離出來的靜止沉降區(qū)的空氣提升式發(fā)酵罐。該空氣提升式發(fā)酵罐包括一個通常用標號1表示的外容器，該外容器包括一個下園柱部分3和一個上園柱部分5，上園柱部分具有一個更大的直徑，並通過一個錐臺段7與下園柱部分3相連接，下園柱部分3有一個完成外容器1的底部15。在圖上一般用標號9表示的一個隔離板是安裝在外容器1內(nèi)，將容器內(nèi)部分成一個提升通道，在圖上一般是用11表示的;和另一個下降通道，在圖上一般是用13表示。底板15在一個空氣入口17，它直接在提升通道11的下面，并大致在提升通道的中心。圖上用9表示的隔離板在外容器的上園柱段5和錐臺段7的范圍中形成一個靜止沉降區(qū)19。該靜止沉降區(qū)的軸向截面是矩形的;並且與提升通道和下降通道是密封的，除了在靜止沉降區(qū)19的底部有一個與下降通道相通的口子21。靜止沉降區(qū)19的頂部有一個用于抽取培養(yǎng)物上清液的出口23，發(fā)酵罐有一個輸送培養(yǎng)介質(zhì)的入口25，在外容器1的里面或周圍可以配備恒溫控制的加熱裝置，外容器可以是雙壁的以提供一個例如可以注入水的夾套。
使用時、細胞，最好是動物細胞的懸浮培養(yǎng)物通過入口25加入到發(fā)酵罐里，使得用9a表示的隔離板9的頂部被深度相當(dāng)于外容器1下園柱段3直徑0.25到1.0倍的懸浮培養(yǎng)物蓋住。懸浮培養(yǎng)物由通過空氣進口17進入的加壓空氣維持湍流狀態(tài)?？諝庠谔嵘ǖ?1里上升，降低了在提升通道11中流體懸浮液的堆密度，引起流體沿圖1箭頭指示的方向作整體運動，空氣在提升通道11頂部的懸浮培養(yǎng)物中釋放。
通過入口25連續(xù)地輸送培養(yǎng)介質(zhì)，培養(yǎng)介質(zhì)包括營養(yǎng)物以及有效培養(yǎng)細胞所必須的其它要素，此外還可以包括0.01到0.03%(W/V)的聚半乳糖醛酸，使用聚半乳糖醛酸促進動物細胞和動物細胞碎片的絮凝，它有助于將動物細胞和碎片從產(chǎn)品流中有效地分離。培養(yǎng)物上清液通過出口23以基本上與通過入口25輸入培養(yǎng)介質(zhì)一樣的速率連續(xù)地被抽取，在從靜止沉降區(qū)19中取出培養(yǎng)物上清液時，懸浮培養(yǎng)物通過口子21從下降通道13的湍流環(huán)境中補充進來。靜止沉降區(qū)19是一個無湍流的區(qū)域，在那里，具有比培養(yǎng)物上清液更大密度的細胞和細胞碎片在重力下向下沉降，取出培養(yǎng)物上清液的速率要使得在靜止沉降區(qū)19中的細胞向下運動，並最終通過口21回到下降通道13中。
在穩(wěn)定狀態(tài)的情況下，在靜止沉降區(qū)19中建立起一個細胞濃度的梯度，使能從出口23取出培養(yǎng)物上清液而從懸浮培養(yǎng)物中很少或不取走大量培養(yǎng)物。錐臺7對外發(fā)酵罐容器1軸的夾角在0°至60°之間，取決于具體工作條件所需要的靜止沉降區(qū)19的大小。在某些場合下，例如在低容積發(fā)酵罐中，外發(fā)酵罐容器1可以是單獨一個園柱形容器，而靜止沉降區(qū)是由一個雙層壁的隔離板形成的區(qū)域，在圖1所示的具體方案中，靜止沉降區(qū)19是由一個起減小該區(qū)擾動的緩沖板27形成的，該緩沖板與發(fā)酵罐軸的夾角是在0°到60°之間，一般與相應(yīng)的錐臺段7相平行。該緩沖板可隨需要選擇，如果有的話，它可以從錐臺段7的一半延伸到全部的垂直距離之間。靜止沉降區(qū)19具有一個取決于發(fā)酵罐中培養(yǎng)的細胞的橫截面積。當(dāng)用哺乳動物的細胞時，沉降區(qū)適合于每立方米發(fā)酵罐容積具有0.1到2.5米2之間的橫截面積，靜止沉降區(qū)19最好是每立方米發(fā)酵罐容積具有0.65米2的橫截面積。
參照圖2，它畫了本發(fā)明的另一個實施方案，從圖上可清楚地知道，圖2所示的空氣提升式發(fā)酵罐具有一些與圖1空氣提升式發(fā)酵罐共同的特征，這些特征這里不再描述了，不同之處在于利用了一個在發(fā)酵罐外容器中同心安置的一個通風(fēng)管29，通風(fēng)管29里面起提升通道的作用，而通風(fēng)管29外側(cè)面與發(fā)酵罐容器內(nèi)側(cè)之間的環(huán)形空間起下降通道的作用。在這個方案中，通風(fēng)管29包括有一個下園柱段31和一個上園柱段33，二個園柱段由一個錐臺段35連接。提升通道向上直徑減小，使在發(fā)酵罐的上端有一個更大的橫截面面積用作靜止沉降區(qū)。靜止沉降區(qū)37是由在通風(fēng)管29上端部和一個與之成整體的套筒38之間形成一個環(huán)形空間組成。一般，圖2所示空氣提升式發(fā)酵罐的運行以及它的各個部件與對圖1所作的描述是一樣的，象在圖1的方案中一樣，靜止沉降區(qū)37的底部有一緩沖板39，用于防止渦流，在圖2的實施方案中，緩沖板39是錐臺形的，在圖1例子中提到的最佳尺寸也適于圖2空氣提升式發(fā)酵罐的部件。
參照附圖3，它是一個空氣提升式發(fā)酵罐，具有特別適合于低容積使用的結(jié)構(gòu)形狀。圖3所示的空氣提升式發(fā)酵罐包括有一個園柱形的外容器41和一個同心安置在該外容器41中的通風(fēng)管43，通風(fēng)管43有雙層壁，在雙層壁之間形成的環(huán)形空間構(gòu)成一個環(huán)形靜止沉降區(qū)45。圖3發(fā)酵罐的運行和一般尺寸與上面對圖1所描述的一樣。
以下的例子說明了用本發(fā)明的發(fā)酵罐來連續(xù)生產(chǎn)動物細胞的懸浮培養(yǎng)物。
例1改進現(xiàn)有的一個5.5升(總?cè)莘e)的空氣提升式發(fā)酵罐，使它能以連續(xù)的方式、在回饋生物體的情況下用于培養(yǎng)哺乳動物的細胞懸浮液。
發(fā)酵罐是通過建造一個雙壁型通風(fēng)管來改進的，通風(fēng)管的壁如圖3所示是平行的，發(fā)酵罐裝有兩條收獲輸送管路，第一條收獲輸送管路從培養(yǎng)物的主要容積處引出到發(fā)酵罐外，使得在沒有回饋生物體的情況下連續(xù)地收取培養(yǎng)物，第二條收獲輸送管路從通風(fēng)管的頂部到發(fā)酵罐的外面(圖3)，使得在回饋生物體到培養(yǎng)物主要容積中去的情況下連續(xù)地收采培養(yǎng)物。
在上述發(fā)酵罐中培養(yǎng)分泌IgM抗體的NB1復(fù)化細胞。培養(yǎng)介質(zhì)是補充牛胎血清的Dulbecco修正的Eagle介質(zhì)，監(jiān)測和自動控制溶介的氧氣壓力，PH值和溫度。用一個改進的Fuch的Rosenthal計數(shù)室進行細胞計數(shù)，而細胞的存活性可由對錐蟲蘭染色的排斥來估計?？贵w用IgM特異酶結(jié)合的免疫吸附劑檢驗法檢驗。
實驗條件和結(jié)果總結(jié)在表1上，在沒有生物體回饋下活細胞的群體密度是1.3×106細胞數(shù)/毫升，而抗體濃度是30.4毫克/升，在有生物體回饋的情況下，89%的活細胞從流出物中被除去，結(jié)果使培養(yǎng)物中的活生物體增加4倍、達到5.3×106細胞數(shù)/毫升。抗體的總輸出量在沒有生物體回饋時是63毫克/天、在有生物體回饋時是323毫克/天。
例2在第二個例子中，一個30升(總?cè)莘e)的空氣提升式發(fā)酵罐被改進成在有生物體回饋下以連續(xù)方式使用。除了對兩個不同構(gòu)形的通風(fēng)管進行試驗外，改進與例1對5升發(fā)酵罐所描述的相同。通風(fēng)管的第一種構(gòu)形如圖3所示、是一個具有平行壁的通風(fēng)管，在第二種構(gòu)形里，為了減少在通風(fēng)管兩個壁之間的液柱中的擾動，通風(fēng)管朝它的下方略微收縮。
細胞系，介質(zhì)和實驗步驟與例1所述相同，結(jié)果總結(jié)在表2中。在沒有生物體回饋的情況下，得到1.6×106細胞數(shù)/毫升的活細胞群體密度，在生物體回饋的條件下，對平行壁通風(fēng)管，活細胞群體密度是6.0×106細胞數(shù)/毫升，對收縮口徑的通風(fēng)管、是3.5×106細胞數(shù)/毫升?？贵w生產(chǎn)量在沒有生物體回饋時是325毫克/天，在在有回饋操作時是630毫克/天。
應(yīng)當(dāng)明白，上面僅僅是以舉例的方式來說明本發(fā)明，可以在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)作出各種具體的改進。
權(quán)利要求
1.一種容納細胞懸浮培養(yǎng)物的連續(xù)式發(fā)酵罐容器，該容器包括有攪動容納在該容器第一部分中的懸浮培養(yǎng)物的裝置；一個使用時形成一靜止沉降區(qū)的該容器的第二部分，第二部分至少有一部分的底部與第一部分相連通；一個用于連續(xù)地將培養(yǎng)介質(zhì)輸送到該容器中的進口裝置；和一個離第二部分底部上面一定距離處將培養(yǎng)物上清液從容器第二部分連續(xù)抽取的出口裝置，使用時，沉降在第二部分中的細胞回到被攪動的懸浮培養(yǎng)物中，而具有比懸浮培養(yǎng)物更低細胞濃度的培養(yǎng)物上清液從該第二部分被抽取。
2.如權(quán)利要求
1所述的連續(xù)式發(fā)酵罐，其特征在于，該靜止沉降區(qū)整個地位于使用時容納被攪動懸浮培養(yǎng)物的發(fā)酵罐部分之中。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的連續(xù)式發(fā)酵罐，其特征在于，發(fā)酵罐中的工作流體的液位使得該靜止沉降區(qū)的頂部被0.25至1.0倍發(fā)酵罐直徑的懸浮培養(yǎng)物所蓋住。
4.由以上任一權(quán)利要求
所述的連續(xù)式發(fā)酵罐，其特征在于，連續(xù)式發(fā)酵罐容器是一個空氣提升式發(fā)酵罐。
5.如權(quán)利要求
3所述的連續(xù)式發(fā)酵罐，其特征在于，靜止沉降區(qū)由在下降通道和上升通道之間的隔離器形成的一個管道組成。
6.如權(quán)利要求
5所述的連續(xù)式發(fā)酵罐，其特征在于，隔離器由一個基本上是園柱形的通風(fēng)管組成，它大體被同心地安置在一個基本上是園柱形的發(fā)酵罐容器內(nèi)。
7.如權(quán)利要求
6所述的連續(xù)式發(fā)酵罐容器，其特征在于，靜止沉降區(qū)是由至少一部分通風(fēng)管內(nèi)外壁之間形成的環(huán)形空間組成。
8.如權(quán)利要求
5所述的連續(xù)式發(fā)酵罐容器，其特征在于，隔離器是由一個安裝在該容器中的基本是垂直的板組成。
9.一個細胞懸浮培養(yǎng)物的方法，包括在按照前面任一權(quán)利要求
的連續(xù)式發(fā)酵罐容器中培養(yǎng)細胞。
10.按權(quán)利要求
9所述的方法，其特征在于，細胞是雜化細胞。
專利摘要
一種象空氣提升式發(fā)酵罐這樣的容納細胞懸浮培養(yǎng)物的連續(xù)式發(fā)酵罐容器，該容器包括有攪動容納在該容器第一部分中的懸浮培養(yǎng)物的裝置；一個使用時形成靜止沉降區(qū)的該容器的第二部分，第二部分至少有一部分底部與第一部分相連通；一個用于將培養(yǎng)介質(zhì)連續(xù)地輸送到該容器中的進口裝置；和一個離第二部分底部上面一定距離處將培養(yǎng)物上清液從容器第二部分連續(xù)抽取的出口裝置，使用時，沉降在第二部分中的細胞被送回到被攪動的懸浮培養(yǎng)物中，而具有比懸浮培養(yǎng)物更低細胞濃度的培養(yǎng)物上清液從該第二部分被抽取。
文檔編號C12N5/02GK86104814SQ86104814
公開日1987年2月25日 申請日期1986年6月20日
發(fā)明者約翰·羅伯特·伯奇, 羅伯特·查爾斯·博拉斯頓 申請人:細胞技術(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan