專利名稱:具有抑制pttg表達(dá)作用的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及由具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白及其編碼基因，以及該融合蛋白的表達(dá)方法和在制備治療PTTG陽性腫瘤及與PTTG過度表達(dá)有關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG基因)是一個(gè)在多種腫瘤中均表達(dá)的原癌基因。近年來的研究結(jié)果表明，PTTG基因是一個(gè)強(qiáng)有力的腫瘤轉(zhuǎn)化基因，可以通過以下多種機(jī)制參與腫瘤的形成與發(fā)展誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化；促進(jìn)其它原癌基因及促瘤因子的表達(dá)；干擾姊妹染色單體分離；促進(jìn)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)參與的腫瘤血管生成等。其中以bFGF與PTTG的關(guān)系最為密切，有學(xué)者甚至認(rèn)為PTTG的某些生物學(xué)作用是通過bFGF而實(shí)現(xiàn)的。bFGF能夠促進(jìn)腫瘤的新血管形成，在腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)過程中發(fā)揮重要作用，而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移往往是治療失敗的原因。因此，將PTTG作為研究和治療腫瘤的靶點(diǎn)，具有重要意義。
選擇性蛋白質(zhì)降解是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和維持自身穩(wěn)定的一個(gè)特性，蛋白酶體是負(fù)責(zé)清除細(xì)胞內(nèi)指令降解蛋白的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。其中泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-Proteasome Pathway)是體內(nèi)最重要的高效蛋白降解途徑。此途徑有兩步驟1)靶蛋白共價(jià)結(jié)合上多個(gè)泛素；2)多泛素化了的靶蛋白被26S蛋白酶體復(fù)合物降解。泛素結(jié)合到靶蛋白上這一過程至少需要三種酶的介導(dǎo)泛素激活酶(E1)，泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)。Skp1-Cullin1-F-box(SCF)復(fù)合物是一種重要的E3酶，由Skp1，Cul1，Rbx1和F-box蛋白四個(gè)部件組成，前三個(gè)是不可變組件，F(xiàn)-box蛋白是可變組件。F-box蛋白是一個(gè)龐大的蛋白家族，目前至少發(fā)現(xiàn)70種以上，其共同特征是一端具有一個(gè)F-box基序與Skp1結(jié)合，另一端具有復(fù)雜的結(jié)合區(qū)域，可以與不同的底物靶蛋白結(jié)合，從而介導(dǎo)靶蛋白通過SCF復(fù)合型E3泛素化后被降解。
從mRNA水平抑制相關(guān)癌基因表達(dá)來對(duì)特定癌基因進(jìn)行研究和治療，是目前較常用的方法，但是對(duì)一些由于不容易降解，長(zhǎng)期存在而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)腫瘤蛋白，從蛋白水平抑制會(huì)更迅速，更可靠。PTTG蛋白高水平長(zhǎng)時(shí)間滯留在細(xì)胞各周期，是造成細(xì)胞不正常轉(zhuǎn)化的原因之一。
β-TrCP蛋白(基因序列GenBank號(hào)為Y14153，蛋白GenBank號(hào)為CAA74572.1)是F-box蛋白家族中的一個(gè)成員，由569個(gè)氨基酸殘基組成，其蛋白結(jié)構(gòu)示意圖見圖1；自氨基端第142至194位氨基酸為F-box基序，能與skp1結(jié)合；第195至256位氨基酸為連接肽，為有效泛素化提供了有利的空間結(jié)構(gòu)；第257至569位氨基酸為7個(gè)WD-40重復(fù)序列，構(gòu)成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，利于與不同的底物蛋白結(jié)合。β-TrCP蛋白廣泛存在于多種人類細(xì)胞中，在體內(nèi)涉及多個(gè)信號(hào)途徑及細(xì)胞周期的調(diào)控。
PBF(基因序列GenBank號(hào)BC019295，PBF蛋白的GenBank號(hào)AAH19295.1)是PTTG結(jié)合因子(PTTG-binding-factor)的簡(jiǎn)稱，PBF基因包含一個(gè)編碼180個(gè)氨基酸的開放閱讀框，PBF mRNA在人體組織中普遍表達(dá)，在體內(nèi)、體外均可特異性地與PTTG相互作用。PBF在第149-166位氨基酸之間包含兩個(gè)NLS(nuclear localizationsignal，核定位信號(hào))序列，NLS介導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核；PTTG不含有NLS序列，PTTG進(jìn)核并發(fā)揮功能需要PBF的NLS序列的參與。另有實(shí)驗(yàn)證明，PBF蛋白C端包含有核定位信號(hào)的30個(gè)氨基酸對(duì)于PBF與PTTG的結(jié)合是必需的，且足夠與PTTG結(jié)合。
泛素化過程中泛素連接酶E3負(fù)責(zé)特異性識(shí)別與結(jié)合底物。近年來，多個(gè)研究小組應(yīng)用重組技術(shù)構(gòu)建重組嵌合泛素連接酶，成功降解了正常情況下非泛素化系統(tǒng)天然底物的某些蛋白。例如通過修飾泛素連接酶復(fù)合物Skp1-Cullin1-F-box(SCF)的底物結(jié)合亞單位F-box構(gòu)成的嵌合F-box蛋白，可靶向性地降解pRB家族蛋白成員、β-catenin和cyclin A-Cdk2。這些研究結(jié)果表明利用重組的泛素連接酶，可靶向性地降解一些疾病相關(guān)分子。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白。
本發(fā)明所提供的具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白，命名為β-TrCP-PBF，是通過連接肽在PBF或由PBF羧基(C)端的第1-30位氨基酸殘基(包含核定位序列)組成的多肽的氨基(N)端連接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基(包含F(xiàn)-box基序)的融合蛋白。
所述連接肽的選擇是多種多樣的，優(yōu)選為柔性肽，其氨基酸殘基序列可為序列表中SEQ ID NO1(GSGSGSGSGS)或1-3個(gè)SEQ ID NO2(GGGGS)等所示的重復(fù)序列。柔性肽易于彎曲，因而可使表達(dá)蛋白正確折疊，且不影響融合蛋白各自的活性結(jié)合區(qū)域。
具體來講，所述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO3；2)序列表中的SEQ ID NO4；
3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO6；5)序列表中的SEQ ID NO7；6)將序列表中SEQ ID NO3-7的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抑制PTTG表達(dá)作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO3由446個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第1-256位為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列，自氨基端第257-266位為連接肽序列，自氨基端第267-446位為PBF；序列表中的SEQ ID NO4由451個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第1-256位為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列，自氨基端第257-271位為連接肽序列，自氨基端第272-451位為PBF；序列表中的SEQ ID NO5由446個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第1-256位為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列，自氨基端第257-266位為連接肽序列，自氨基端第267-446位為PBF；序列表中的SEQ ID NO6由441個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第1-256位為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列，自氨基端第257-261位為連接肽序列，自氨基端第262-441位為PBF；序列表中的SEQ ID NO7由296個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第1-256位為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列，自氨基端第257-266位為連接肽序列，自氨基端第267-296位為PBF羧基端的第1-30位氨基酸殘基。
編碼上述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白的基因(β-TrCP-PBF)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO9的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO10的DNA序列；4)序列表中SEQ ID NO11的DNA序列；5)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；5)編碼序列表中SEQ ID NO3-7的DNA序列；6)與序列表中SEQ ID NO8-12限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抑制PTTG表達(dá)作用的核苷酸序列；7)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO8-12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID NO8由1341個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1338位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-798位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第799-1338位堿基為PBF的編碼序列；序列表中的SEQ ID NO9由1356個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1353位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-813位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第814-1356位堿基為PBF的編碼序列；序列表中的SEQ ID NO10由1341個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1338位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-798位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第799-1338位堿基為PBF的編碼序列；序列表中的SEQ ID NO11由1326個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1323位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO6的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-783位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第784-1323位堿基為PBF的編碼序列；序列表中的SEQ ID NO12由891個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-888位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-798位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第799-888位堿基為PBF羧基端第1-30位氨基酸殘基的編碼序列。
含有本發(fā)明融合蛋白基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
為方便純化，在上述重組表達(dá)載體中具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的5’端還連接有His-tag或FLAG-tag編碼序列。
用于構(gòu)建含有本發(fā)明融合蛋白基因的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為任意一種原核或真核表達(dá)載體；所述原核表達(dá)載體可為pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等；所述真核表達(dá)載體可為pCMV5、pSilence1.0-U6(Ambion，Austin，TX，USA)、pcDNA、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(購于Promega公司)、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5等。
以pET-32a為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的重組表達(dá)載體為pET32a-βTrCP-PBF、pET32a-βTrCP-PBF3、pET32a-βTrCP-PBF2、pET32a-βTrCP-PBF1或pET32a-βTrCP-PBF30。
以pCMV5為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的重組表達(dá)載體為pCMV5-β-TrCP-PBF、pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1或pCMV5-β-TrCP-PBF30。
上述重組表達(dá)載體可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
擴(kuò)增上述融合蛋白編碼基因中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還提供了一種表達(dá)上述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)上述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白的方法，是將上述含有具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白。
所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌可為E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)或E.coli Top10等。
所述酵母菌優(yōu)選為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏畢赤酵母優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GS115、KM71(購自美國(guó)Invitrogen公司)或SMD1168(購自美國(guó)Invitrogen公司)。
上述重組菌可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
培養(yǎng)含有具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。其中，培養(yǎng)所述重組大腸桿菌宿主時(shí)需加入誘導(dǎo)劑，如IPTG等，所加入IPTG的濃度為0.5-1.0mmol/L，優(yōu)選為1mmol/L，誘導(dǎo)溫度為16-37℃，優(yōu)選為28℃，誘導(dǎo)時(shí)間為2-4小時(shí)，優(yōu)選為4小時(shí)。
本發(fā)明還提供了一種治療PTTG陽性腫瘤及與PTTG過表達(dá)相關(guān)疾病的藥物。
本發(fā)明所提供的治療性藥物，它的活性成分為上述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白或其編碼基因。
所述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因可存在于真核表達(dá)載體中。
所述含有具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的真核表達(dá)載體可為pCMV5-β-TrCP-PBF、pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1或pCMV5-β-TrCP-PBF30。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述基因藥物載體包括(但不僅限于)攜帶基因的載體，如脂質(zhì)體、重組病毒載體等；攜帶蛋白藥物的載體，如(但不僅限于)其它的蛋白或多肽成分；所述載體還包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述蛋白藥物和基因藥物的用量可采用藥學(xué)領(lǐng)域中蛋白藥物和基因藥物的常規(guī)劑量，并可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。
本發(fā)明提供了一種具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白β-TrCP-PBF及其編碼基因。該融合蛋白保留β-TrCP蛋白N端包含F(xiàn)-box基序的部分而將C端的底物蛋白結(jié)合區(qū)域置換為能夠特異性結(jié)合PTTG的PBF或其C端第1-30位氨基酸殘基(包含核定位序列)，并用柔性連接肽(如“GSGSGSGSGS”等)把兩者連結(jié)起來可以提高該融合蛋白的空間對(duì)接柔韌性。β-TrCP-PBF中的PBF區(qū)域負(fù)責(zé)對(duì)PTTG靶向性結(jié)合，F(xiàn)-box基序負(fù)責(zé)與Skp1結(jié)合然后形成SCF型E3，從而特異性介導(dǎo)PTTG蛋白泛素化、降解。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的β-TrCP-PBF不僅可顯著下調(diào)外源PTTG蛋白的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染有β-TrCP-PBF基因真核表達(dá)載體的PTTG陽性細(xì)胞(如Hela細(xì)胞)內(nèi)源PTTG蛋白表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染前顯著下調(diào)，此外細(xì)胞的增殖能力(有一定的促調(diào)亡能力)及細(xì)胞克隆形成能力也均被抑制。本發(fā)明的融合蛋白β-TrCP-PBF及其編碼基因?qū)⒃赑TTG的功能研究和制備治療PTTG陽性腫瘤及與PTTG過度表達(dá)有關(guān)的疾病的藥物中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
圖1為β-TrCP及本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF的結(jié)構(gòu)示意圖圖2為載體pCMV5的物理圖譜圖3為pCMV5-β-TrCP-PBF載體的雙酶切鑒定結(jié)果圖4為pCMV5-β-TrCP-PBF與pEGFP-N3-PTTG共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞以檢測(cè)本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF對(duì)外源PTTG蛋白表達(dá)水平影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5為本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF對(duì)PTTG陽性的宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞內(nèi)源PTTG蛋白表達(dá)水平影響的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果圖6為本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF對(duì)PTTG陽性的宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞增殖數(shù)量影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖7為本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF對(duì)PTTG陽性的宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞克隆增殖能力影響的顯微鏡觀察結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。
實(shí)施例1、融合蛋白基因β-TrCP-PBF的獲得及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建一、氨基端連接Flag-tag序列的β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基編碼序列的擴(kuò)增提取MCF-7細(xì)胞系(購自上海細(xì)胞所)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA并以此為模板，在引物TRC7(上游引物)5’-GTCTCTAGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAAATGGACCCGGCCGAGG-3’(帶下劃線堿基為Flag-tag編碼序列)和TRC6(下游引物)5’-GTCGGATCCACTATGTCTTCCACATCTCCAATTAGATTC-3’的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增氨基端連接Flag-tag序列的β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基編碼序列，同時(shí)在擴(kuò)增片段兩端引入限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I酶切位點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為819bp的目的片段，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列正確的5’端連接Flag-tag編碼序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位堿基構(gòu)成的基因片段，即氨基端連接Flag-tag序列的β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基編碼序列?；厥詹⒓兓撃康钠巍?br> 二、氨基端連接“GSGSGSGSGS”連接肽序列的PBF編碼序列的克隆以MCF-7細(xì)胞系cDNA為模板，在引物PBF3(上游引物)5’-CTGGGATCCGGCTCAGGCTCAGGATCAGGCTCAATGGCGCCCGGAGTGG-3’(帶下劃線堿基為“GSGSGSGSGS”連接肽編碼序列)和PBF2(下游引物)5’-CTTCCCGGGTTAGTTGTTTTCAAATCTAGCATACG-3’的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增氨基端連接“GSGSGSGSGS”連接肽(序列表中SEQ ID NO1)序列的PBF編碼序列，同時(shí)在擴(kuò)增片段兩端引入限制性內(nèi)切酶BamH I和Sma I酶切位點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為585bp的目的片段，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列正確的5’端連接“GSGSGSGSGS”連接肽編碼序列的PBF基因片段，即氨基端連接“GSGSGSGSGS”連接肽序列的PBF編碼序列。回收并純化該目的片段。
此外，用普通PCR擴(kuò)增的方法還獲得了下述DNA片段(同時(shí)在擴(kuò)增片段兩端引入限制性內(nèi)切酶BamH I和Sma I酶切位點(diǎn))1)氨基端連接三個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的連接肽的PBF編碼序列；2)氨基端連接二個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的連接肽的PBF編碼序列；3)氨基端連接“GGGGS”連接肽的PBF編碼序列；4)氨基端連接“GSGSGSGSGS”連接肽的PBF羧基端的第1-30位氨基酸殘基組成的多肽的編碼序列。
三、重組嵌合分子β-TrCP-PBF真核表達(dá)載體的構(gòu)建如圖2所示，載體pCMV5(GenBank號(hào)AF239249)包含CMVCMV啟動(dòng)子，842-913位堿基；MCS多克隆位點(diǎn)，902-986位堿基；SV40SV40起始位點(diǎn)，1817-1894位堿基；T7T7啟動(dòng)子，2023-2005位堿基；pBR322_originpBR322起始位點(diǎn)，3043-2424位堿基；Ampicillin氨芐青霉素抗藥性基因，4058-3198位堿基；f1_originf1起始位點(diǎn)，4207-4513位堿基。用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sma I對(duì)載體pCMV5進(jìn)行雙酶切后，用T4 DNA連接酶將實(shí)施例1步驟一擴(kuò)增的5’端連接Flag-tag編碼序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位堿基構(gòu)成的基因片段(兩端添加有Xba I和BamH I酶切位點(diǎn))和實(shí)施例1步驟二擴(kuò)增的5’端連接“GSGSGSGSGS”連接肽編碼序列的PBF基因片段(兩端添加有BamH I和Sma I酶切位點(diǎn))與線性化的pCMV5中連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性單克隆，提取質(zhì)粒，分別用Xba I和SmaI，Xba I和BamH I，BamH I和Sma I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖3所示(泳道M為DNA Marker，泳道1為重組質(zhì)粒的Xba I和Sma I的雙酶切鑒定結(jié)果，泳道2為重組質(zhì)粒的Xba I和BamH I的雙酶切鑒定結(jié)果，泳道3為重組質(zhì)粒的BamH I和Sma I的雙酶切鑒定結(jié)果)，重組質(zhì)粒經(jīng)Xba I和Sma I雙酶切獲得了約1386bp的DNA片段，重組質(zhì)粒經(jīng)Xba I和BamH I雙酶切獲得了約813bp的DNA片段，重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Sma I雙酶切獲得了約579bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符。對(duì)上述重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，除去Flag-tag編碼序列及酶切位點(diǎn)外，載體中插入的外源DNA片段具有序列表中SEQ ID NO8的核苷酸序列，由1341個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1338位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-798位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第799-1338位堿基為PBF的編碼序列。將所構(gòu)建的β-TrCP-PBF的真核表達(dá)載體命名為pCMV5-β-TrCP-PBF。
此外，用上述方法將實(shí)施例1步驟一擴(kuò)增的5’端連接Flag-tag編碼序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位堿基構(gòu)成的基因片段(兩端添加有Xba I和BamH I酶切位點(diǎn))分別和實(shí)施例1步驟二擴(kuò)增的5’端連接三個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列連接肽編碼序列的PBF基因片段(兩端添加有BamH I和Sma I酶切位點(diǎn))、5’端連接二個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列連接肽編碼序列的PBF基因片段(兩端添加有BamH I和Sma I酶切位點(diǎn))、5’端連接“GGGGS”重復(fù)序列連接肽編碼序列的PBF基因片段(兩端添加有BamH I和Sma I酶切位點(diǎn))、5’端連接“GSGSGSGSGS”連接肽編碼序列的PBF羧基端的第1-30位氨基酸殘基組成的多肽的編碼序列與線性化的pCMV5中連接，得到下述重組真核表達(dá)載體1)含有連接肽為三個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的融合蛋白基因的真核表達(dá)載體，命名為pCMV5-β-TrCP-PBF3，該融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO9的核苷酸序列，由1356個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1353位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-813位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第814-1356位堿基為PBF的編碼序列；2)含有連接肽為二個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的融合蛋白基因的真核表達(dá)載體，命名為pCMV5-β-TrCP-PBF2，該融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO10的核苷酸序列，由1341個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1338位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-798位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第799-1338位堿基為PBF的編碼序列；3)含有連接肽為“GGGGS”的融合蛋白基因的真核表達(dá)載體，命名為pCMV5-β-TrCP-PBF1，該融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO11的核苷酸序列，由1326個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1323位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO6的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-783位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第784-1323位堿基為PBF的編碼序列；4)含有連接肽為“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸殘基組成的多肽的氨基端連接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基的融合蛋白基因的真核表達(dá)載體，命名為pCMV5-β-TrCP-PBF30，該融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO12的核苷酸序列，由891個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-888位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-768位堿基為β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基序列的編碼序列，自5’端第769-798位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第799-888位堿基為PBF羧基端第1-30位氨基酸殘基的編碼序列。將本發(fā)明的融合蛋白基因統(tǒng)稱為β-TrCP-PBF，其編碼蛋白統(tǒng)稱為β-TrCP-PBF，該蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。
實(shí)施例2、檢測(cè)本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF對(duì)PTTG基因表達(dá)的抑制作用一、檢測(cè)本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF對(duì)外源PTTG-EGFP融合蛋白表達(dá)情況的影響將實(shí)施例1構(gòu)建的攜帶有本發(fā)明融合蛋白基因的真核表達(dá)載體pCMV5-β-TrCP-PBF與攜帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的PTTG蛋白基因的質(zhì)粒pEGFP-N3-PTTG(pEGFP-N3-PTTG是PTTG-EGFP融合蛋白基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后能表達(dá)出帶綠色熒光蛋白標(biāo)記的PTTG蛋白，此融合蛋白在藍(lán)色激發(fā)光下能發(fā)出綠色熒光。質(zhì)粒pEGFP-N3-PTTG的構(gòu)建方法提取MCF-7細(xì)胞系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA并以此為模板，在引物MP5(上游引物)5’-CGTCAATTCGCCACCATGGCTACTCTGATCTATGTTG-3’和MP6(下游引物)5’-CAGGGATCCAATATCTATGTCACAGCAAACAG-3’的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增PTTG基因片段(Genbank號(hào)AF095287)，并在擴(kuò)增片段兩端分別添加EcoR I和BamH I酶切為點(diǎn)，然后將載體pEGFP-N3(CLONTECH生物技術(shù)公司)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切后，用T4 DNA連接酶將上述PCR擴(kuò)增的PTTG基因片段與線性化的pEGFP-N3連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性單克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定及測(cè)序鑒定，最終得到攜帶PTTG-EGFP融合蛋白基因的目標(biāo)質(zhì)粒pEGFP-N3-PTTG。)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，檢測(cè)本發(fā)明融合蛋白對(duì)PTTG表達(dá)的影響，具體方法為將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COS-7細(xì)胞以每孔1×105細(xì)胞量接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)液為含10％胎牛血清(HYCLONE公司)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90-95％時(shí)，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑(Gibco公司)并參照說明書將質(zhì)粒pCMV5-β-TrCP-PBF和pEGFP-N3-PTTG按1∶1的比例共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，對(duì)照細(xì)胞以同樣的方法共轉(zhuǎn)染pCMV5空載體和pEGFP-N3-PTTG(1∶1)，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用熒光顯微鏡(OLYMPUS IX51)觀察和拍照，用Image-pro plus v5.02Sofeware分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PTTG的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4所示(ApCMV5空載體和pEGFP-N3-PTTG共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，BpCMV5-β-TrCP-PBF和pEGFP-N3-PTTG共轉(zhuǎn)染細(xì)胞)，pCMV5-β-TrCP-PBF和pEGFP-N3-PTTG共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光亮度明顯比空質(zhì)粒pCMV5和pEGFP-N3-PTTG共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光亮度弱，表明本發(fā)明的融合蛋白β-TrCP-PBF能顯著下調(diào)外源PTTG蛋白的表達(dá)。
用上述相同方法還將pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1、pCMV5-β-TrCP-PBF30分別和pEGFP-N3-PTTG共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，以檢測(cè)本發(fā)明連接肽為1-3個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的融合蛋白β-TrCP-PBF以及連接肽為“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸殘基組成的多肽的氨基端連接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基的融合蛋白對(duì)外源PTTG蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果轉(zhuǎn)染有攜帶本發(fā)明融合蛋白基因的真核表達(dá)載體的細(xì)胞的熒光亮度明顯比空質(zhì)粒pCMV5和pEGFP-N3-PTTG共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光亮度弱，表明本發(fā)明的融合蛋白β-TrCP-PBF能顯著下調(diào)外源PTTG蛋白的表達(dá)。
二、檢測(cè)本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF對(duì)PTTG陽性癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)源PTTG表達(dá)水平的影響以人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞為例，將實(shí)施例1構(gòu)建的攜帶有本發(fā)明融合蛋白基因的真核表達(dá)載體pCMV5-β-TrCP-PBF轉(zhuǎn)染PTTG陽性癌細(xì)胞，以檢測(cè)本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF對(duì)PTTG陽性癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)源PTTG表達(dá)水平的影響，具體方法為將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞以每孔2×105細(xì)胞量接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)液為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90-95％時(shí)，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑將質(zhì)粒pCMV5-β-TrCP-PBF轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，對(duì)照細(xì)胞以同樣的方法轉(zhuǎn)染pCMV5空載體。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲細(xì)胞，首先用免疫印跡(Western blot)檢測(cè)融合蛋白β-TrCP-PBF對(duì)PTTG蛋白水平的影響，一抗為抗PTTG抗體(購自SANTA CRUZ)，二抗為羊抗兔(購自SANTA CRUZ)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，與轉(zhuǎn)染pCMV5的對(duì)照細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela細(xì)胞中PTTG蛋白水平顯著下調(diào)，表明本發(fā)明的融合蛋白β-TrCP-PBF能下調(diào)內(nèi)源PTTG蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)還統(tǒng)計(jì)了兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第1、2、3、4天的細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6所示，與轉(zhuǎn)染pCMV5的對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，表明本發(fā)明的融合蛋白β-TrCP-PBF能有效抑制與PTTG過度表達(dá)有關(guān)的細(xì)胞(PTTG陽性腫瘤細(xì)胞)的增殖，并有促凋亡的作用。此外，將分別轉(zhuǎn)染pCMV5、pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela細(xì)胞以每孔1×103細(xì)胞量接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，并于第7天在顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成情況，結(jié)果如圖7所示，與轉(zhuǎn)染pCMV5的對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela細(xì)胞細(xì)胞克隆形成明顯減少，表明本發(fā)明的融合蛋白β-TrCP-PBF能有效抑制與PTTG過度表達(dá)有關(guān)的細(xì)胞(PTTG陽性腫瘤細(xì)胞)的克隆增殖能力。
用上述相同方法還將pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1、pCMV5-β-TrCP-PBF30分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，以檢測(cè)本發(fā)明連接肽為1-3個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的融合蛋白β-TrCP-PBF以及連接肽為“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸殘基組成的多肽的氨基端連接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基的融合蛋白對(duì)內(nèi)源PTTG蛋白表達(dá)水平及PTTG陽性細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞克隆形成能力的影響，結(jié)果轉(zhuǎn)染有攜帶上述本發(fā)明融合蛋白基因的真核表達(dá)載體的Hela細(xì)胞內(nèi)PTTG的表達(dá)水平明顯比空質(zhì)粒pCMV5轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)PTTG的表達(dá)水平低，且細(xì)胞細(xì)胞增殖數(shù)量及細(xì)胞克隆形成與對(duì)照空質(zhì)粒pCMV5轉(zhuǎn)染細(xì)胞比也均明顯減少，表明本發(fā)明的融合蛋白β-TrCP-PBF能顯著下調(diào)內(nèi)源PTTG蛋白的表達(dá)，PTTG陽性細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞克隆形成能力，可用于制備治療PTTG陽性腫瘤及與PTTG過度表達(dá)有關(guān)疾病的藥物。
實(shí)施例3、本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF的原核表達(dá)用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sma I對(duì)原核表達(dá)載體pET-32a(Novagen公司)進(jìn)行雙酶切后，用T4 DNA連接酶將實(shí)施例1步驟一擴(kuò)增的5’端連接Flag-tag編碼序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位堿基構(gòu)成的基因片段(兩端添加有Xba I和BamH I酶切位點(diǎn))和實(shí)施例1步驟二擴(kuò)增的5’端連接“GSGSGSGSGS”連接肽編碼序列的PBF基因片段(兩端添加有BamH I和Sma I酶切位點(diǎn))與線性化的載體pET-32a連接，得到本發(fā)明融合蛋白β-TrCP-PBF的原核表達(dá)載體，命名為pET32a-βTrCP-PBF
用同樣方法還獲得了含有連接肽為三個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的β-TrCP-PBF基因的原核表達(dá)載體(命名為pET32a-βTrCP-PBF3)，含有連接肽為二個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的β-TrCP-PBF基因的原核表達(dá)載體(命名為pET32a-βTrCP-PBF2)，含有連接肽為“GGGGS”的β-TrCP-PBF基因的原核表達(dá)載體(命名為pET32a-βTrCP-PBF1)，含有連接肽為“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸殘基組成的多肽的氨基端連接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基的β-TrCP-PBF基因的原核表達(dá)載體(命名為pET32a-βTrCP-PBF30)
，再將上述原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組菌，然后按1∶100的比例將陽性重組菌接種至含100mg/mL氨芐青霉素的1000mL LB液體培養(yǎng)基中在37℃下進(jìn)行大量培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600值約為0.8)，加入化學(xué)誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1mmol/L，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，4℃、6000rpm離心15min收集菌體，用100mL TE緩沖液(20mmol/L，pH8.0)重懸菌體沉淀，加入溶菌酶(1mg/mL)于室溫磁力攪拌10min；冰浴中超聲波(30s/開，20s/停，15個(gè)循環(huán))破碎菌體；4℃、12000rpm離心20min分別收集包涵體沉淀和上清。將包涵體沉淀用1mol/L的NaCl(TE配制)洗滌1次，4℃、12000rpm離心20min以去除包涵體中的雜蛋白，棄上清后再用TE緩沖液洗滌2次，4℃、12000rpm離心20min收集沉淀，利用Flag-tag對(duì)表達(dá)的上述融合蛋白β-TrCP-PBF進(jìn)行純化，得到純化的本發(fā)明連接肽為“GSGSGSGSGS”的β-TrCP-PBF、連接肽為三個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的β-TrCP-PBF、連接肽為二個(gè)“GGGGS”重復(fù)序列的β-TrCP-PBF、連接肽為“GGGGS”的β-TrCP-PBF及連接肽為“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸殘基組成的多肽的氨基端連接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基的β-TrCP-PBF。
序列表<160>12<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser1 5 10<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>3<211>446<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met1 5 10 15Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys20 25 30Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala35 40 45Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met50 55 60Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser65 70 75 80Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys85 90 95Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp100 105 110Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln115 120 125His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe130 135 140Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys165 170 175Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180 185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220
Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Ala Pro Gly Val Ala260 265 270Arg Gly Pro Thr Pro Tyr Trp Arg Leu Arg Leu Gly Gly Ala Ala Leu275 280 285Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Ala Ala Ala Gln Glu Pro Pro Gly Ala290 295 300Ala Cys Ser Gln Asn Thr Asn Lys Thr Cys Glu Glu Cys Leu Lys Asn305 310 315 320Val Ser Cys Leu Trp Cys Asn Thr Asn Lys Ala Cys Leu Asp Tyr Pro325 330 335Val Thr Ser Val Leu Pro Pro Ala Ser Leu Cys Lys Leu Ser Ser Ala340 345 350Arg Trp Gly Val Cys Trp Val Asn Phe Glu Ala Leu Ile Ile Thr Met355 360 365Ser Val Val Gly Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Ile Cys Cys Cys370 375 380Cys Cys Cys Arg Arg Lys Arg Ser Arg Lys Pro Asp Arg Ser Glu Glu385 390 395 400Lys Ala Met Arg Glu Arg Glu Glu Arg Arg Ile Arg Gln Glu Glu Arg405 410 415Arg Ala Glu Met Lys Thr Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly420 425 430Leu Phe Lys Glu Glu Asn Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn435 440 445<210>4<211>451<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met1 5 10 15Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys20 25 30Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala35 40 45Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met50 55 60Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser65 70 75 80Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys85 90 95Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp100 105 110Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln115 120 125His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe130 135 140Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys165 170 175Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180 185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205
Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met260 265 270Ala Pro Gly Val Ala Arg Gly Pro Thr Pro Tyr Trp Arg Leu Arg Leu275 280 285Gly Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Ala Ala Ala Gln290 295 300Glu Pro Pro Gly Ala Ala Cys Ser Gln Asn Thr Asn Lys Thr Cys Glu305 310 315 320Glu Cys Leu Lys Asn Val Ser Cys Leu Trp Cys Asn Thr Asn Lys Ala325 330 335Cys Leu Asp Tyr Pro Val Thr Ser Val Leu Pro Pro Ala Ser Leu Cys340 345 350Lys Leu Ser Ser Ala Arg Trp Gly ValCys Trp Val Asn Phe Glu Ala355 360 365Leu Ile Ile Thr Met Ser Val Val Gly Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ile370 375 380Ala Ile Cys Cys Cys Cys Cys Cys Arg Arg Lys Arg Ser Arg Lys Pro385 390 395 400Asp Arg Ser Glu Glu Lys Ala Met Arg Glu Arg Glu Glu Arg Arg Ile405 410 415Arg Gln Glu Glu Arg Arg Ala Glu Met Lys Thr Arg His Asp Glu Ile420 425 430Arg Lys Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Glu Glu Asn Pro Tyr Ala Arg Phe435 440 445Glu Asn Asn450
<210>5<211>446<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>5Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met1 5 10 15Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys20 25 30Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala35 40 45Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met50 55 60Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser65 70 75 80Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys85 90 95Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp100 105 110Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln115 120 125His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe130 135 140lle Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys165 170 175
Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180 185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Pro Gly Val Ala260 265 270Arg Gly Pro Thr Pro Tyr Trp Arg Leu Arg Leu Gly Gly Ala Ala Leu275 280 285Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Ala Ala Ala Gln Glu Pro Pro Gly Ala290 295 300Ala Cys Ser Gln Asn Thr Asn Lys Thr Cys Glu Glu Cys Leu Lys Asn305 310 315 320Val Ser Cys Leu Trp Cys Asn Thr Asn Lys Ala Cys Leu Asp Tyr Pro325 330 335Val Thr Ser Val Leu Pro Pro Ala Ser Leu Cys Lys Leu Ser Ser Ala340 345 350Arg Trp Gly Val Cys Trp Val Asn Phe Glu Ala Leu Ile Ile Thr Met355 360 365Ser Val Val Gly Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Ile Cys Cys Cys370 375 380Cys Cys Cys Arg Arg Lys Arg Ser Arg Lys Pro Asp Arg Ser Glu Glu385 390 395 400Lys Ala Met Arg Glu Arg Glu Glu Arg Arg Ile Arg Gln Glu Glu Arg405 410 415Arg Ala Glu Met Lys Thr Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly420 425 430
Leu Phe Lys Glu Glu Asn Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn435 440 445<210>6<211>441<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>6Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met1 5 10 15Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys20 25 30Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala35 40 45Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met50 55 60Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser65 70 75 80Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys85 90 95Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp100 105 110Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln115 120 125His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe130 135 140Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile145 150 155 160
Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys165 170 175Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180 185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Pro Gly Val Ala Arg Gly Pro Thr Pro260 265 270Tyr Trp Arg Leu Arg Leu Gly Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ile275 280 285Pro Val Ala Ala Ala Gln Glu Pro Pro Gly Ala Ala Cys Ser Gln Asn290 295 300Thr Asn Lys Thr Cys Glu Glu Cys Leu Lys Asn Val Ser Cys Leu Trp305 310 315 320Cys Asn Thr Asn Lys Ala Cys Leu Asp Tyr Pro Val Thr Ser Val Leu325 330 335Pro Pro Ala Ser Leu Cys Lys Leu Ser Ser Ala Arg Trp Gly Val Cys340 345 350Trp Val Asn Phe Glu Ala Leu Ile Ile Thr Met Ser Val Val Gly Gly355 360 365Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Ile Cys Cys Cys Cys Cys Cys Arg Arg370 375 380Lys Arg Ser Arg Lys Pro Asp Arg Ser Glu Glu Lys Ala Met Arg Glu385 390 395 400Arg Glu Glu Arg Arg Ile Arg Gln Glu Glu Arg Arg Ala Glu Met Lys405 410 415
Thr Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Glu Glu420 425 430Asn Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn435 440<210>7<211>296<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>7Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met1 5 10 15Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys20 25 30Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala35 40 45Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met50 55 60Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser65 70 75 80Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys85 90 95Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp100 105 110Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln115 120 125His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe130 135 140Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys
165 170 175Lys Glu Trp Tyr Arg ValThr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180 185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Arg Ala Glu Met Lys Thr260 265 270Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Glu Glu Asn275 280 285Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn290 295<210>8<211>1341<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag 60agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt 120agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca 180agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc 240agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg 300tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt 360atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg 420cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt 480
ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac 540cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat 600tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa 660cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata 720caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg atccggctca 780ggctcaggat caggctcaat ggcgcccgga gtggcccgcg ggccgacgcc gtactggagg 840ttgcgcctcg gtggcgccgc gctgctcctg ctgctcatcc cggtggccgc cgcgcaggag 900cctcccggag ctgcttgttc tcagaacaca aacaaaacct gtgaagagtg cctgaagaac 960gtctcctgtc tttggtgcaa cactaacaag gcttgtctgg actacccagt tacaagcgtc 1020ttgccaccgg cttccctttg taaattgagc tctgcacgct ggggagtttg ttgggtgaac 1080tttgaggcgc tgatcatcac catgtcggta gtcgggggaa ccctcctcct gggcattgcc 1140atctgctgct gctgctgctg caggaggaag aggagccgga agccggacag gagtgaggag 1200aaggccatgc gtgagcggga ggagaggcgg atacggcagg aggaacggag agcagagatg 11260aagacaagac atgatgaaat cagaaaaaaa tatggcctgt ttaaagaaga aaacccgtat 1320gctagatttg aaaacaacta a 1341<210>9<211>1356<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>9atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag 60agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt 120agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca 180agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc 240agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg 300tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt 360atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg 420cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt 480ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac 540cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat 600
tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa 660cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata 720caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg cggaggtgga 780tctggtggcg gaggaagcgg aggtggcgga tctatggcgc ccggagtggc ccgcgggccg 840acgccgtact ggaggttgcg cctcggtggc gccgcgctgc tcctgctgct catcccggtg 900gccgccgcgc aggagcctcc cggagctgct tgttctcaga acacaaacaa aacctgtgaa 960gagtgcctga agaacgtctc ctgtctttgg tgcaacacta acaaggcttg tctggactac 1020ccagttacaa gcgtcttgcc accggcttcc ctttgtaaat tgagctctgc acgctgggga 1080gtttgttggg tgaactttga ggcgctgatc atcaccatgt cggtagtcgg gggaaccctc 1140ctcctgggca ttgccatctg ctgctgctgc tgctgcagga ggaagaggag ccggaagccg 1200gacaggagtg aggagaaggc catgcgtgag cgggaggaga ggcggatacg gcaggaggaa 1260cggagagcag agatgaagac aagacatgat gaaatcagaa aaaaatatgg cctgtttaaa 1320gaagaaaacc cgtatgctag atttgaaaac aactaa 1356<210>10<211>1341<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag 60agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt 120agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca 180agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc 240agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg 300tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt 360atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg 420cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt 480ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac 540cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat 600tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa 660cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata 720
caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg cggaggtgga 780tctggtggcg gaggaagcat ggcgcccgga gtggcccgcg ggccgacgcc gtactggagg 840ttgcgcctcg gtggcgccgc gctgctcctg ctgctcatcc cggtggccgc cgcgcaggag 900cctcccggag ctgcttgttc tcagaacaca aacaaaacct gtgaagagtg cctgaagaac 960gtctcctgtc tttggtgcaa cactaacaag gcttgtctgg actacccagt tacaagcgtc 1020ttgccaccgg cttccctttg taaattgagc tctgcacgct ggggagtttg ttgggtgaac 1080tttgaggcgc tgatcatcac catgtcggta gtcgggggaa ccctcctcct gggcattgcc 1140atctgctgct gctgctgctg caggaggaag aggagccgga agccggacag gagtgaggag 1200aaggccatgc gtgagcggga ggagaggcgg atacggcagg aggaacggag agcagagatg 1260aagacaagac atgatgaaat cagaaaaaaa tatggcctgt ttaaagaaga aaacccgtat 1320gctagatttg aaaacaacta a 1341<210>11<211>1326<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag 60agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt 120agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca 180agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc 240agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg 300tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt 360atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg 420cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt 480ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac 540cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat 600tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa 660cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata 720caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg cggaggtgga 780tctatggcgc ccggagtggc ccgcgggccg acgccgtact ggaggttgcg cctcggtggc 840
gccgcgctgc tcctgctgct catcccggtg gccgccgcgc aggagcctcc cggagctgct 900tgttctcaga acacaaacaa aacctgtgaa gagtgcctga agaacgtctc ctgtctttgg 960tgcaacacta acaaggcttg tctggactac ccagttacaa gcgtcttgcc accggcttcc 1020ctttgtaaat tgagctctgc acgctgggga gtttgttggg tgaactttga ggcgctgatc 1080atcaccatgt cggtagtcgg gggaaccctc ctcctgggca ttgccatctg ctgctgctgc 1140tgctgcagga ggaagaggag ccggaagccg gacaggagtg aggagaaggc catgcgtgag 1200cgggaggaga ggcggatacg gcaggaggaa cggagagcag agatgaagac aagacatgat 1260gaaatcagaa aaaaatatgg cctgtttaaa gaagaaaacc cgtatgctag atttgaaaac 1320aactaa 1326<210>12<211>891<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag 60agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt 120agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca 180agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc 240agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg 300tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt 360atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg 420cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatatcgc tgagaacatt 480ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac 540cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat 600tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa 660cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata 720caagacattg agacaataga atctaattgg agatgtggaa gacatagtgg atccggctca 780ggctcaggat caggctcaag agcagagatg aagacaagac atgatgaaat cagaaaaaaa 840tatggcctgt ttaaagaaga aaacccgtat gctagatttg aaaacaacta a 891
權(quán)利要求
1.具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白，是通過連接肽在PBF或由PBF羧基端的第1-30位氨基酸殘基組成的多肽的氨基端連接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸殘基的融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的融合蛋白，其特征在于所述連接肽的氨基酸殘基序列為序列表中SEQ ID NO1或1-3個(gè)SEQ ID NO2所示的重復(fù)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO3；2)序列表中的SEQ ID NO4；3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO6；5)序列表中的SEQ ID NO7；6)將序列表中SEQ ID NO3-7的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抑制PTTG表達(dá)作用的蛋白質(zhì)。
4.編碼權(quán)利要求
1或2或3所述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO9的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO10的DNA序列；4)序列表中SEQ ID NO11的DNA序列；5)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；5)編碼序列表中SEQ ID NO3-7的DNA序列；6)與序列表中SEQ ID NO8-12限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抑制PTTG表達(dá)作用的核苷酸序列；7)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO8-12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求
4或5所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體中具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的5’端還連接有His-tag或FLAG-tag編碼序列；用于構(gòu)建含有所述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)、pET-30a、pCMV5、pSilence1.0-U6、pcDNA、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5；以pET-32a為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的重組表達(dá)載體為pET32a-βTrCP-PBF、pET32a-βTrCP-PBF3、pET32a-βTrCP-PBF2、pET32a-βTrCP-PBF1或pET32a-βTrCP-PBF30；以pCMV5為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的重組表達(dá)載體為pCMV5-β-TrCP-PBF、pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1或pCMV5-β-TrCP-PBF30。
8.一種表達(dá)權(quán)利要求
1或2或3所述的具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白的方法，是將權(quán)利要求
6或7所述含有具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白；所述宿主為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌。
9.權(quán)利要求
1或2或3所述的具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白在制備治療PTTG陽性腫瘤及與PTTG過表達(dá)相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求
3或4所述的具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因在制備治療PTTG陽性腫瘤及與PTTG過表達(dá)相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用；所述具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因存在于真核表達(dá)載體中；所述含有具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白基因的重組表達(dá)載體為pCMV5-β-TrCP-PBF、pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1或pCMV5-β-TrCP-PBF30。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供一種具有抑制PTTG表達(dá)作用的融合蛋白及其編碼基因與其在制備治療PTTG陽性腫瘤藥物中的應(yīng)用。該融合蛋白是通過連接肽在PBF或由PBF羧基端的第1－30位氨基酸殘基組成的多肽的氨基(N)端連接β－TrCP自氨基端第1－256位氨基酸殘基的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白β－TrCP－PBF及其編碼基因?qū)⒃赑TTG的功能研究和制備治療PTTG陽性腫瘤及與PTTG過度表達(dá)有關(guān)的疾病的藥物中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1995065SQ200610169706
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月27日
發(fā)明者蔣宇揚(yáng), 謝振華, 莫卓華, 李文鵬 申請(qǐng)人:清華大學(xué)深圳研究生院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan