一種廣譜抑制癌細胞生長的蚯蚓蛋白及其編碼序列的制作方法

專利名稱:一種廣譜抑制癌細胞生長的蚯蚓蛋白及其編碼序列的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和醫學領域，特別是涉及蚯蚓中一種可廣譜抑制癌細胞生長的蛋白質的多核苷酸序列，以及由此多核苷酸編碼的蛋白質序列，此外，還涉及所述蛋白質的制備方法及其抑癌活性等。
背景技術：
蚯蚓俗稱地龍，具有解熱、鎮驚、降壓、抑菌及活血化瘀等功效，已廣泛應用于中醫中藥中治療多種疾病。到了上世紀80年代，又陸續報道蚯蚓抽提物對多種癌細胞具有抑制作用，并在初步臨床應用中取得了一定的抑癌效果(第四軍醫大學學報，1986，7(2)85；中國腫瘤臨床，1991，18(2)131；山西醫學院學報，1995，26(2)81；生物化學與生物物理學報，2002，34(5)576)。
但是，對蚯蚓中抑制癌細胞生長的有效成份及其作用機理卻至今未見報道。鑒于蚯蚓中抑癌成分的潛在應用前景，迫切需要對其進行基礎及開發應用研究。

發明內容本發明的第一個目的是提供蚯蚓中一種可廣譜抑制癌細胞生長的蛋白質。
本發明的第二個目的是提供編碼所述蛋白質的多核苷酸序列。
本發明的第三個目的是提供制備所述蛋白質的方法。
本發明的第四個目的是提供所述蛋白質的抑癌用途及其它用途。
在本發明的第一方面，提供一種分離的蚯蚓EFE6多肽，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個(較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑癌功能的由(a)衍生的多肽。
在本發明的一個優選例中，該多肽是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
本發明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼所述多肽的多核苷酸；或(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
在本發明的一個優選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在另一優選例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的序列。
在另一優選例中，所述的多核苷酸可以是對編碼所述多肽的基因進行人工定點突變后所獲得的基因突變體的DNA核苷酸序列。
本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。
本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體。
本發明的第五方面，提供一種多肽的制備方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養所述的宿主細胞；或(b)從培養物中分離出蚯蚓EFE6多肽。
本發明的第六方面，提供一種能與所述的蚯蚓EFE6多肽特異性結合的抗體。
本發明的第七方面，提供一種藥物組合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
本發明的第八方面，提供了本發明所述的蚯蚓EFE6多肽的用途，它被用于(a)制備治療癌癥的藥物；(b)制備具有酯酶活性的藥物；或(c)制備具有纖維蛋白溶解活性的藥物。
本發明的其它方面由于本文技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
下列附圖用于說明本發明的具體實施方案。
圖1顯示了從蚯蚓中分離的廣譜抑癌蛋白質的SDS-PAGE圖譜，其中泳道1為抑癌蛋白質，泳道2為標準分子量蛋白質。
圖2顯示了蚯蚓抑癌蛋白質在HPLC中的層析圖譜。
圖3顯示了蚯蚓抑癌蛋白質的PCR擴增條帶，泳道1為DNA標準，泳道2為PCR擴增產物。
圖4顯示了蚯蚓抑癌蛋白質的基因序列及其編碼的蛋白質序列。
圖5顯示了蚯蚓抑癌蛋白質在原核表達載體(PGEX4T-1)中的構建過程。
圖6顯示了蚯蚓抑癌蛋白質表達產物的SDS-PAGE圖譜(圖6A)和Western圖譜(圖6B)。
圖7顯示了蚯蚓抑癌蛋白質對幾種癌細胞生長的抑制作用。
具體實施方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首先從蚯蚓中分離得到一種廣譜抑制癌細胞生長的蛋白質，基于此完成了本發明。
更具體的，本發明人首先從威廉腔環蚓(Metaphire guillelmi)抽提物中分離到一種分子量24744.67道爾頓的廣譜抑制癌細胞生長的蛋白質，測定了此蛋白質N端的一段氨基酸序列為NH2-I-L-G-G-Q-D-A-S-P-G-(SEQ ID NO3)，并以此為依據合成了相應的引物，然后從蚯蚓中分離有關的mRNA為模板，經反轉錄獲得cDNA，用PCR法擴增和克隆了蚯蚓抑癌蛋白質的基因，測定了此基因的全序列，然后將蚯蚓抑癌蛋白質的編碼序列插入合適載體并轉入合適的宿主細胞中，表達及分離重組的蚯蚓抑癌蛋白質，并通過Westren印跡分析加以鑒定。本發明人將此蛋白命名為“EFE6蛋白”。
本發明人除了從威廉腔環蚓中分離純化得到了所述抑癌蛋白質外，還從其它的蚯蚓品種中分離得到了所述抑癌蛋白質，例如，赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)等。
在本發明中，術語“EFE6蛋白”、“EFE6多肽”或“蚯蚓抑癌蛋白EFE6”可互換使用，都指具有蚯蚓抑癌蛋白質EFE6氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的蚯蚓抑癌蛋白質EFE6。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的EFE6蛋白或多肽”是指EFE6多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白質、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化EFE6蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。EFE6多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括EFE6蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然EFE6蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白質原序列，或與抗體IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發明中，術語“EFE6多肽”指具有EFE6蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術語還包括具有與EFE6蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括了EFE6蛋白的活性片段和/或活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與EFE6 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質、以及利用抗EFE6多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含EFE6多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了EFE6多肽的可溶性片段。通常，該片段具有EFE6多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供EFE6蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然EFE6多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“EFE6蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ IDNO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼EFE6蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的EFE6核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白質(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白質序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki等，Science 1985；2301350-1354)被優選用于獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或EFE6蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的EFE6多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼EFE6多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，EFE6多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J BioChem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含EFE6編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白質。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白質沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的EFE6蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療因類似EFE6蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或對抗EFE6蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組EFE6蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激EFE6蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對EFE6 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于EFE6基因產物或片段。較佳地，指那些能與EFE6基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制EFE6蛋白的分子，也包括那些并不影響EFE6蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的EFE6基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的EFE6基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達EFE6蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature.256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷EFE6蛋白功能的抗體以及不影響EFE6蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用EFE6基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與EFE6基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗EFE6蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的EFE6蛋白。
本發明中的抗體可用于治療或預防與EFE6蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷EFE6蛋白的產生或活性。
抗體也可用于設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如EFE6蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅EFE6蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產可用EFE6蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發明蛋白質，通過各種常規篩選方法，可篩選出與EFE6蛋白發生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明蛋白質及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果，尤其是可用于抑制腫瘤或腫瘤細胞(體內或體外)的生長。
腫瘤例子包括但并不限于各種實體腫瘤，如肺癌、小細胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睪丸癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宮頸癌。較佳地，所述的腫瘤選自下組肺癌、肝癌、乳房癌、或前列腺癌。
通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于癌癥方面的治療。在使用本發明EFE6蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如紫杉醇等。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明EFE6多肽以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的EFE6蛋白施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
EFE6蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于EFE6蛋白的無表達或異常/無活性的EFE6蛋白的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的EFE6蛋白，以抑制內源性的EFE6蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將EFE6基因轉移至細胞內。構建攜帶EFE6基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook等，分子克隆實驗指南)。另外重組EFE6基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
抑制EFE6 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與EFE6蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對EFE6蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測EFE6蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的EFE6蛋白水平，可以用作解釋EFE6蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷EFE6蛋白起作用的疾病。
一種檢測樣品中是否存在EFE6蛋白的方法是利用EFE6蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與EFE6蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在EFE6蛋白。
EFE6蛋白的多聚核苷酸可用于EFE6蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，EFE6蛋白的多聚核苷酸可用于檢測EFE6蛋白的表達與否或在疾病狀態下EFE6蛋白的異常表達。如EFE6 DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷EFE6蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用EFE6蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測EFE6蛋白的轉錄產物。
檢測EFE6基因的突變也可用于診斷EFE6蛋白相關的疾病。EFE6蛋白突變的形式包括與正常野生型EFE6 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白質的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據本發明EFE6蛋白的cDNA制備PCR引物(優選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯。這些數據可見于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary聯機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業已定位到染色體區域上的疾病之間的關系。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。更具體的，本發明人首先從威廉腔環蚓(Metaphire guillelmi)抽提物中分離到一種分子量24744.67道爾頓的廣譜抑制癌細胞生長的蛋白質，測定了此蛋白質N端的一段氨基酸序列為NH2-I-L-G-G-Q-D-A-S-P-G-(SEQ ID NO3)，并以此為依據合成了相應的引物，然后從蚯蚓中分離有關的mRNA為模板，經反轉錄獲得cDNA，用PCR法擴增和克隆了蚯蚓抑癌蛋白質的基因，測定了此基因的全序列，然后將蚯蚓抑癌蛋白質的編碼序列插入合適載體并轉入合適的宿主細胞中，表達及分離重組的蚯蚓抑癌蛋白質，并通過Westren印跡分析加以鑒定。本發明人將此蛋白命名為“EFE6蛋白”。
本發明人除了從威廉腔環蚓中分離純化得到了所述抑癌蛋白質外，還從其它的蚯蚓品種中分離得到了所述抑癌蛋白質，例如，赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)等。本發明的蛋白質可為治療癌癥相關疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應用前景。
本發明所述的蚯蚓抑癌蛋白質EFE6的其它生物活性，是指該蛋白質還具有水解BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)的酯酶活性和水解纖維蛋白及纖維蛋白原的纖維蛋白溶解活性。
本發明的主要優點在于從繁雜的蚯蚓抽提物中純化到單一純度的抑癌蛋白質，此抑癌蛋白質對培養的正常細胞是無毒或低毒的。本發明同時克隆到蚯蚓抑癌蛋白質的基因，分析測定了基因序列，并成功地進行了表達，這不僅為開發研究蚯蚓抑癌蛋白質的基因工程產品創造了良好的條件，也為開發蚯蚓抑癌蛋白質針劑應用于臨床治療腫瘤疾病提供了必要的化學結構資料，因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 從蚯蚓中分離純化天然的抑癌蛋白質在實驗中本發明人主要采用了威廉腔環蚓進行抽提并分離純化，獲得了具有抑癌活性的組份。此外還采用了赤子愛勝蚓，也獲得了相同的結果。
以威廉腔勝蚓為例，取鮮活蚯蚓若干，洗凈后經機械搗碎，加入冰冷的丙酮或乙醇脫水，所得沉淀晾干，即為粗蚯蚓粉，儲藏-20℃冰箱中備用。
取粗蚯蚓粉若干，加兩倍體積的水浸泡過夜，次日以5000rmp冷凍離心，收集上清液并裝入透析袋對水透析24h，再在5000rmp離心，上清液經冷凍干燥成凍干粉，純化時取凍干粉少許以緩沖液溶解，然后經離子交換和凝膠過濾層析分離，得到單一的抑癌蛋白質組份，具體地，依據下列兩種鑒定方法確定為單一組份。
本發明人對獲得的抑癌蛋白質組份進行了HPLC分析，結果為單一峰，見圖2。
本發明人對獲得的抑癌蛋白質組份進行了SDS-PAGE分析為單一條帶，見圖1。
實施例2 蚯蚓抑癌蛋白質N-端10個氨基酸序列測定純化的蚯蚓抑癌蛋白質樣品在PE491蛋白質測序儀上經過10個循環，測得的N-端氨基酸序列為ILGGQDASPG。
實施例3 引物的設計和合成根據實施例2測得的蚯蚓抑癌蛋白質的N-端序列，設計上游寡核苷酸兼并引物為5’AT(T/C/A)CT(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)CA(A/G)GA(T/C)GC3’(SEQ ID NO4)(括號內為兼并核苷酸)，由于缺乏蚯蚓抑癌蛋白質的C-端氨基酸序列信息，下游引物選用OligdT20，引物合成委托上海生工生物工程公司完成。
實施例4 總RNA的提取取蚯蚓體腔內組織100mg，在液氮中研磨成粉，加1ml Trizol試劑繼續研磨成勻漿，然后轉移至離心管內，4℃，12000g離心10min，上清液吸入新的離心管，25℃水浴5min，加入0.2ml氯仿，充分振蕩15s，25℃水浴5min，4℃12000g離心15min，取上層水相加0.5ml異丙醇，25℃水浴10min，4℃12000g離心10min，收集沉淀，用1ml 75％乙醇洗滌，4℃7500g離心5min，敞口于空氣中干燥5-10min，使乙醇充分揮發，加入100μl水溶解，58℃水浴10min，-70℃保存。
實施例5 RT-PCR擴增蚯蚓抑癌蛋白質基因以實施例4中制得的蚯蚓總RNA為模板，利用Invitrogen公司的試劑盒(kit)進行反轉錄，按操作說明書進行。
使用實施例3中的合成引物，從上述所得cDNA為模板，進行PCR擴增，總反應體系25μl，其中模板1μl，上游引物2μl(250pM/μl)，OligdT(10pM/μl)0.5μl，高保真酶0.5μl(5u/μl)，dNTP(2.5mM)2μl，反應條件是先94℃變性3min，然后進入循環，94℃25s，51℃退火45s，72℃延伸1.5min，進行31個循環，最后72℃保溫10min，取PCR產物進行1％瓊脂糖電泳檢查，擴增出一條約1000bp的DNA片膠，見圖3。產物以氯仿抽提，乙醇沉淀回收，溶于10μl的滅菌水中。
實施例6 蚯蚓抑癌蛋白質的基因克隆。
取PCR回收產物2μl與T-載體1μl連接，轉化，經藍白斑篩選，酶切和PCR鑒定，獲得陽性克隆。
實施例7 蚯蚓抑癌蛋白質基因的鑒定實施例6中獲得的陽性克隆委托博亞公司測定，基因全序列和編碼的蛋白質序列見SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，或見圖4。該成熟蛋白的cDNA編碼717個核苷酸(序列中未列出起始密碼子和終止密碼子)，即239個氨基酸。
經電腦軟件分析該蛋白質的分子量為24744.67，等電點為4.28。
實施例8 兔抗蚯蚓抑癌蛋白質抗體的制備取體重為2公斤左右的雄性新西蘭大耳兔一只，以1mg蚯蚓抑癌蛋白質樣品加弗氏完全佐劑研磨成乳膠狀，在兔頸部多點注射，飼養半個月后，以1mg蚯蚓抑癌蛋白質加弗氏不完全佐劑研成乳膠狀，再在兔頸部多點注射，一個月后再1mg蚯蚓抑癌蛋白質加弗氏不完全佐劑再次加強免疫，飼養半個月后頸動脈取血，4℃靜置過夜，2000轉離心3分鐘，上清液為兔抗蚯蚓抑癌蛋白質抗體。
實施例9 蚯蚓抑癌蛋白質的基因表達和鑒定為核實該基因所編碼的蚯蚓抑癌蛋白質就是天然提取的蚯蚓抑癌蛋白質，將該基因的翻譯區克隆到原核表達載體PGEX4T-1(購自Pharmacia Biotech)的EcoRI和XholI酶切位點中，見圖5。然后將重組載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中并誘導基因表達。
用實施例8中制得的兔抗蚯蚓抑癌蛋白質抗體與表達產物進行SDS-PAGE圖譜和Western雜交鑒定。
結果見圖6，由結果可見，所表達的蛋白質與蚯蚓抑癌蛋白質抗體能夠專一性地結合。
實施例10 蚯蚓抑癌蛋白質對多種培養的癌細胞的抑制作用在本實施例中，分別選用了下列幾種常規的癌細胞進行抑制試驗SMCC7721(人肝癌細胞)，SW620(人結腸癌細胞)，H08910(人卵巢癌細胞)，HepG2(人肝細胞肝癌)，A549(人肺癌細胞)，BCAP-37(人乳腺癌細胞)，HeLa(人宮頸癌細胞)，BGC823(人低分化胃腺癌細胞)，T24(人膀胱癌細胞)和L1210(小鼠白血病細胞)。上述癌細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，或可購自美國ATCC。
各種細胞分為對照組和測試組，測試組中EFE6蛋白的終濃度為50μg/ml。24小時培養后，與對照組細胞相比。
結果發現，除了L1210(小鼠白血病細胞)以外，其它各個加入EFE6蛋白的測試組中癌細胞生長均發生明顯抑制，可見EFE6蛋白有明顯的抑癌效果，但其對L1210(小鼠白血病細胞)無作用。具體結果見圖7。
實施例11 蚯蚓抑癌蛋白質的其它生物活性的測定1.檢測酯酶活性以BAEE為底物測定了蚯蚓抑癌蛋白質的酯酶活性，結果表明蚯蚓抑癌蛋白質水解BAEE。測定所用BAEE溶解在pH 7.8，0.05M Tris-HCl緩沖液中，濃度為0.8×10-3M，取2.9ml底物溶液加0.1ml EFE6蛋白(終濃度為10微克/毫升)。
在253nM下測定光密度變化，經計算EFE6蛋白水解BAEE的效價為100活力單位/毫克蛋白質。
2.檢測纖溶活性按Deogny所描述的纖維蛋白平板法(Clinica Chimica Acta，1975，6085)測定了蚯蚓抑癌蛋白質的纖溶活性，通過測量溶圈的面積計算纖溶活性的大小，結果表明蚯蚓抑癌蛋白質具有纖溶活性，活力達25,000mm2/mg EFE6蛋白。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求
書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>一種廣譜抑制癌細胞生長的蚯蚓蛋白及其編碼序列<130>059726<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>717<212>DNA<213>威廉腔環蚓(Metaphire guillelmi)<400>1atcctggggg gacaggatgc ctctcctgga gagttcccgt ggcaactgtc ccagttgaga 60ggtggaagcc acagctgcgg agcctctctc ctccacgcga cagctgctct cagtgccgcc 120cactgcgtcg acggagcact cgtatcatcc gttgatgtca tcgccggtct tcatcggcga 180tcagatctta ctggaacaca gacttcagct gctgcgtcat tcagcattaa cgtgaactac 240gataacggag agggtacatt cgcacatgat atctccatca tccacctcgc cacagccatc 300gacgcctcgc cagccaacat cgcgtttttg acccttcctc cagacaacag ctatcagttt 360actggtgaca cctgcactct cagtggatgg ggacgtacat ctgccagtaa cattcttccg 420gacacgctgc agaaagtcga cattgaagta atcagcacag acgagtgcaa cgttcgtatg 480gctaccgtca ttggtgccga ctgcactgat aatcaaatcg cagttttcga tgttgccgag 540aacgagggat cgtgcaacgg tgacagcgga ggcccgatga actgccagct caatggtcag 600actgtggttg ccggaataac gtcgtgggga atccagtcgg gcggcgcctg tgcaccatcc 660tacccatctg tctacaccag gacttcagcc taccttcaat ggatcagcga caaccaa 717<210>2<211>239<212>PRT<213>威廉腔環蚓(Metaphire guillelmi)<400>2
Ile Leu Gly Gly Gln Asp Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gln Leu1 5 10 15Ser Gln Leu Arg Gly Gly Ser His Ser Cys Ala Ala Ser Leu Leu His20 25 30Ala Thr Ala Ala Leu Ser Ala Ala His Cys Val Asp Gly Ala Leu Val35 40 45Ser Ser Val Asp Val Ile Ala Gly Leu His Arg Arg Ser Asp Leu Thr50 55 60Gly Thr Gln Thr Ser Ala Ala Ala Ser Phe Ser Ile Asn Val Asn Tyr65 70 75 80Asp Ash Gly Glu Gly Thr Phe Ala His Asp Ile Ser Ile Ile His Leu85 90 95Ala Thr Ala Ile Asp Ala Ser Pro Ala Asn Ile Ala Phe Leu Thr Leu100 105 110Pro Pro Asp Asn Ser Tyr Gln Phe Thr Gly Asp Thr Cys Thr Leu Ser115 120 125Gly Trp Gly Arg Thr Ser Ala Ser Asn Ile Leu Pro Asp Thr Leu Gln130 135 140Lys Val Asp Ile Glu Val Ile Ser Thr Asp Glu Cys Asn Val Arg Met145 150 155 160Ala Thr Val Ile Gly Ala Asp Cys Thr Asp Asn Gln Ile Ala Val Phe165 170 175Asp Val Ala Glu Asn Glu Gly Ser Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro180 185 190Met Asn Cys Gln Leu Asn Gly Gln Thr Val Val Ala Gly Ile Thr Ser195 200 205Trp Gly Ile Gln Ser Gly Gly Ala Cys Ala Pro Ser Tyr Pro Ser Val210 215 220Tyr Thr Arg Thr Ser Ala Tyr Leu Gln Trp Ile Ser Asp Asn Gln225 230 235<210>3<211>10<212>PRT<213>威廉腔環蚓(Metaphire guillelmi)
<400>3Ile Leu Gly Gly Gln Asp Ala Ser Pro Gly1 5 10<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n＝a，t，c或g<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n＝a，t，c或g<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n＝a，t，c或g<400>4athctnggng gncargaygc 20
權利要求
1.一種分離的蚯蚓多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑癌功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求
1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求
1所述多肽的多核苷酸；或(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求
3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.一種載體，其特征在于，它含有權利要求
3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求
5所述的載體。
7.一種權利要求
1所述多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求
6所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出權利要求
1所述的蚯蚓多肽。
8.一種能與權利要求
1所述的蚯蚓多肽特異性結合的抗體。
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求
1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
10.權利要求
1所述的蚯蚓多肽的用途，其特征在于，所述的蚯蚓多肽用于(a)制備治療癌癥的藥物；(b)制備具有酯酶活性的藥物；或(c)制備具有纖維蛋白溶解活性的藥物。
專利摘要
本發明公開了一種新的可廣譜抑制癌細胞生長的蛋白質EFE6、編碼所述蛋白質EFE6的多核苷酸序列以及制備所述蛋白質的方法。本發明的EFE6蛋白首先從蚯蚓中分離得到。本發明的蛋白質具有廣譜的抑癌用途，并且還具有酯酶活性和纖維蛋白溶解活性。
文檔編號A61P43/00GK1990504SQ200510112490
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月30日
發明者劉小龍, 繆紅華, 王曉明, 朱洪, 王益清, 徐丹, 周元聰 申請人:中國科學院上海生命科學研究院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan