專利名稱:用于檢測山羊痘病毒的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種獸醫學的檢測試劑盒，確切講是一種用于用于檢測山羊痘病毒的試劑盒。
背景技術：
羊痘(Capripox，CP)包括綿羊痘、山羊痘和牛的皮膚疙瘩病，其中前兩者是由綿羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)分別引起綿羊和山羊發生的接觸性傳染病。病畜體溫升高，全身出現丘疹或結節、水皰、內臟病變甚至死亡，給世界養羊業造成了嚴重的經濟損失。世界動物衛生組織(OIE)將其規定為法定必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病。綿羊痘和山羊痘的鑒別診斷一直是研究的熱點。
綿羊痘和山羊痘的鑒別診斷一直是研究的熱點。研究表明，SPPV和GTPV基因序列同源性達到96%-97%，僅在基因組末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差異，見:Tulman, E.R., Afonso, C.L., Lu, Z., Zsak, L., Sur, J.H.,Sandybaevj N.T.，Kerembekovaj U.Z.，Zaitsev, V.L，Kutishj G.F.，Rock, D.L，2002.The genomes of sheeppox and goatpox viruses.J Virol.76， 6054-6061.。一般來說，SPPV、GTPV具有較嚴格的宿主嗜性，但有一些研究表明試這兩種病毒也可發生宿主嗜性改變，引起交叉感染，見:M.G.Garner, S.D.Sawarkar, E.K.Brett, J.R.Edwards, V.B.Kulkarni, D.B.Boyle;S.N.th e Extent and Impact of Sheep Poxand Goat Pox in the State of Maharashtra, India , Tropical Animal Health andProduction.2000，32(4):205-223.，繼而可能導致錯誤的臨床診斷和獲得不準確的流行病學信息，不利于對該病的有效防控。對羊痘病毒分離株進行準確的種屬鑒別有助于解決生產中遇到的這個問題，但SPPV和GTPV之間抗原性具有明顯交叉，用血清學方法很難區別開來，需通過分子生物學方法進行鑒別，見:Sheeppox and goatpox virus.World Organisation for Animal Health (2009).- Terrestrial Animal Health Code.0ΙΕ, Paris.。準確鑒定分離株種屬和弄清其來源將有助于羊痘的流行病學分析，具有重要意義。
目前為止，基于基因序列分析的分子生物學鑒別綿羊痘病毒和山羊痘病毒的方法并不十分成熟，前期發明人的實驗室通過克隆結合酶切的方法分析P32基因和GPCR基因建立了 PCR-RFLP方法，見:顏新敏，吳國華，李健等.山羊痘病毒感染綿羊的診斷及其基因的分子分析.中國獸醫科學，2011，41 (01): 14.，但是該方法需要專用的PCR儀器和酶切操作，相對來說比較繁瑣且費用較多，不利于生產實踐中的實際應用。而國內肖雯等建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR方法擴增靈敏度僅為1.71X106 copies/μ L的GTPV基因組模板，且同樣需要專門的PCR儀器，因此該方法在生產實踐中也存在這局限性，見:肖雯，聶福平，王昱等.綿羊痘病毒和山羊痘病毒雙重PCR檢測方法的建立及應用.中國預防獸醫學報.2012，7(7):551-554.。康文玉等建立了可檢測羊痘病毒屬的實時定量PCR方法，該方法以PCR為靶基因設計引物和探針進行綿羊痘病毒和山羊痘病毒的檢測，見康文玉，徐自忠，花群義等.羊痘病毒實時熒光定量TaqMan PCR檢測方法的建立.中國獸醫科學，2006.36(07):529-533.。程振濤、姚俊等也分別基于山羊痘病毒基因組不同的基因片段建立了檢測山羊痘病毒的實時定量PCR，見:程振濤，岳筠，李永明等.山羊痘病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法的建立與應用.生物工程學報，2009，25; 25 (3):464-47.姚俊，永軍，彭海生等.山羊痘病毒SYBR Green I實時定量PCR檢測方法的建立，動物醫學進展，2012，33(7):32-39.。但是以上方法均需要專用的價格昂貴的熒光定量PCR儀，而且對操作者要求相對較高，因此在實際生產中還是有一定的局限。
環等溫介導技術(loopmediated isothermal amplication, LAMP)由于其具有快速、簡便、無需特殊儀器等優點，目前已被廣泛應用于各種疾病病原的檢測中。盡管國內外均已有人針對羊痘病毒屬基因設計并建立了能夠檢測羊痘病毒屬的Lamp方法，如美國科學家Amaresh Das等人建立了靈敏度比較高的Lamp方法，見:Amaresh Das,Shawn Babiuk, and Michael T.McIntosh.Development of a Loop-Mediated IsothermalAmplification Assay for Rapid Detection of Capripoxviruses.Journal of ClinicalMicrobiology.2012, 1613
發明內容
本發明提供一種用于檢測山羊痘病毒的試劑盒。
本發明的用于檢測山羊痘病毒的試劑盒中至少包括有四條引物，分別是SEQIDNa USEQ ID Na 2, SEQ ID Ns 3和SEQ ID Ns 4，所涉及的序列見序列表及后敘內容。
為方便使用，在本發明的用于檢測山羊痘病毒的試劑盒內還可放置有dNTP、Tris-HC、KCl、(NH4) 2S04、MgS04、Tween 20 和 Bst 酶，以及模板 DNA。
本發明是一種用于檢測山羊痘病毒的LAMP檢測試劑盒，其相應的檢測是應用特定的引物進行LAMP擴增，環等溫介導技術(loop mediated isothermal amplication,LAMP)具有快速、簡便、無需特殊儀器等優點。采用本發明試劑盒內的引物可以特異性擴增山羊痘病毒核酸，在進行檢測時可以對被檢樣品進行擴增，然后根據擴增產物的核酸電泳檢測到是否有特異性條帶確定被檢樣品是否帶有山羊痘病毒。本發明的引物具有特異性，在同等條件下不能擴增綿羊痘病毒的核酸，同時本發明的檢測靈敏度較高，同時具有檢測操作相對簡單、快速的優點，可在羊痘病毒流行病學研究中應用及疾病的防控中應用。
本發明中設計選取山羊痘病毒基因組的反向末端重復序列ITR區為靶基因，專門設計了只能匹配山羊痘病毒而不能匹配山綿羊痘病毒的特異性Lamp引物。本發明的試劑盒能夠檢測山羊痘病毒的試劑盒能夠快捷高效靈敏的檢測出山羊痘病毒，而不與同屬的綿羊痘病毒發生交叉反應。因此，本發明可快速特異性地從病料中或者培養的細胞毒中檢測出山羊痘病毒，從而判定是山羊痘病毒而不是綿羊痘病毒或別的病原體感染。而且本發明涉及的試劑盒最低可檢測出1.045X IO6個拷貝的模板，靈敏度高于同類能區分檢測出山羊痘病毒的分子生物學方法中的雙重PCR方法和PCR-RFLP方法，且不需要使用專門的PCR儀和DNA酶，因此在使用成本和時間上都占有一定的優勢。
附圖1為山羊痘病毒lamp引物擴增溫度梯度優化，擴增60min后核酸電泳檢測圖，其中60°C、62°C和64°C均有擴增條帶產生，66°C和對照組均無條帶產生，此圖可看出本發明所設計的山羊痘病毒lamp引物擴增溫度可選擇60°C、62°C和64°C中任意一個溫度。
附圖2為山羊痘病毒lamp引物擴增在62°C下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結果。其中擴增60min后均有擴增條帶產生，擴增30min、45min、和對照組均無條帶產生，此圖可看出本發明所設計的通用山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增時間可在60min之后擴增出特異性條帶。
圖3為以羊的不同病原體基因組為模板，以山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增60 min后核酸電泳檢測結果。其中M表不IOObp DNA Ladder marker ;1為山羊痘病毒擴增產物；2為綿羊痘病毒擴增產物；3為羊水泡病毒擴增產物；4為支原體擴增產物；5為衣原體擴增產物；6為螺旋體擴增產物；7為弓形蟲擴增產物；8為羊泰勒蟲擴增產物；9為羊巴貝斯蟲擴增產物；10為陰性對照。由圖可見，山羊痘病毒lamp引物特異性擴增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無特異性產物產生，陰性對照組無條帶產生，說明山羊痘病毒lamp引物特異性很高。
圖4為山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結果，擴增時間為60min。其中M代表IOObp DNA marker ；1為IO7個拷貝，2為IO6個拷貝；3為IO5個拷貝，4為IO4個拷貝；5為IO3個拷貝，6為IO2個拷貝，7為IO1個拷貝，8為10°個拷貝，9為KT1個拷貝，10為10_2個拷貝，11為陰性對照。由圖可見，IO7-1O4個拷貝的模板均有特異性產物產生，隨著模板量的減少，產物條帶變暗。對照組無條帶產生，此圖可看出本發明所設計的山羊痘病毒lamp引物在62°C下，擴增60min之后最少可檢出IO4個拷貝的模板。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明進行詳細解說。
1.序列的制備
本發明的擴增引物應用相關的引物設計軟件對羊痘病毒基因組反向重復末端(l-2000bp內)設計，再從獲得的數百對引物中選擇評分較高的引物，再將設計好的序列發送至南京金斯瑞生物工程有限公司進行5’端修飾合成得到。最終確定的這些序列是:
SEQ Na 1:ACCAAAACAAATAATCAGAGATG，在本發明中被命名為 GTPV F3 ；
SEQ Na 2:CCTAATCCATTTAAGACACTACG，在本發明中被命名為 GTPV B3 ；
SEQ Na 3:AAGATGTCTTCCGGTAACTATGTCT-GCGGTTGTGATATCGTCA,在本發明中被命名為GTPV FIP
SEQ Na 4: CCGAACTTGTTATTTCTTGTGCTT-CACAATAAGGAACCACCTAGA，在本發明中被命名為 GTPV BIP。
2.病毒基因組提取
將VeiO細胞接種細胞培養瓶，單層細胞長至80%以上融合后，接種羊痘病毒病毒，370C孵育Ih后棄去毒液。加入細胞維持液含有1%胎牛血清DMEM，370C 5%C02培養，定期觀察細胞病變(CPE)Jt 90%以上細胞出現CPE后收毒。將病毒反復凍融3次，置-20°C冰箱保存備用。使用TaKaRa公司DNA提取試劑盒提取細胞毒株中的DNA，獲得的病毒DNA即可用于檢測。
3.Lamp擴增條件優化
以上一步驟提取純化的病毒DNA為模板進行擴增，實驗體系如下:
F30.2 μ M
Β30.2μΜ
FIP1.6μΜ
BIP1.6μΜ
dNTPL4mM (每種)
Tris-HCl20mM
KCl:1OmM
(NH4)2SO4IOmM
MgSO44mM
Tween 200.2%
Bst 酶8U
模板DNA2 μ L
3.1反應溫度的優化
在進行lamp引物的反應溫度的確定時，按照上述體系加入反應物。以山羊痘病毒基因組為模板，反應溫度設為60°C、62°C、64°C的水浴鍋或PCR儀中進行，反應時間為60 min,結束后80°C加熱2 min,各取2μ L Lamp產物樣品核酸電泳，電泳結果通過紫外凝膠成像系統進行檢測并拍照。檢測結果見圖1.檢測結果顯示，山羊痘病毒lamp引物擴增溫度梯度優化，擴增60min后核酸電泳檢測結果。其中60°C、62°C和64°C均有擴增條帶產生，66°C和對照組均無條帶產生，此圖可看出本發明所設計的山羊痘病毒lamp引物擴增溫度可選擇60°C、62°C和64°C中任意一個溫度。
3.2反應時間的優化
在進行lamp引物的反應時間的確定時，按照上述體系加入反應物。以山羊痘病毒基因組為模板，反應溫度設為62°C的水浴鍋或PCR儀中進行,反應時間為3(T60 min,結束后80°C加熱2 min,各取2 μ L Lamp產物樣品核酸電泳，電泳結果通過紫外凝膠成像系統進行檢測并拍照。其檢測結果見圖2。
檢測結果顯示，山羊痘病毒lamp引物擴增在62°C下擴增不同時間的后核酸電泳檢測結果。其中擴增60min后均有擴增條帶產生,擴增30min、45min、和對照組均無條帶產生，此圖可看出本發明所設計的通用山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增時間可在60min之后擴增出特異性條帶。
3.3 反應特異性檢測
在進行lamp引物的反應特異性的檢測時，按照上述體系加入反應物。模板分別為綿羊痘病毒、山羊痘病毒、羊水泡病毒、支原體、為衣原體、螺旋體、弓形蟲、羊泰勒蟲、羊巴貝斯蟲。反應溫度設為62°C的水浴鍋或PCR儀中進行，反應時間按優化結果，綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用lamp引物設為45min、綿羊痘病毒lamp引物反應60min、山羊痘病毒lamp引物為60 min。反應結束后80°C加熱2 min，之后取出反應管，各取2 μ L Lamp產物樣品核酸電泳，電泳結果通過紫外凝膠成像系統進行檢測并拍照。其檢測結果見圖3.檢測結果顯示以羊的不同病原體基因組為模板，以羊的不同病原體基因組為模板，在62°C下擴增60 min后核酸電泳檢測結果。山羊痘病毒lamp引物特異性擴增出了山羊痘病毒基因片段，而其他病原體均無特異性產物產生，陰性對照組無條帶產生，說明山羊痘病毒lamp引物非常特異。
3.4反應靈敏度檢測
在進行lamp引物的反應靈敏度檢測時，按照上述體系加入反應物。以山羊痘病毒基因組為模板，模板均通過核酸測定儀測定濃度計算出拷貝數，分別稀釋出濃度梯度為107 10_2個拷貝共計10個梯度作為模板。反應溫度設為62°C的水浴鍋或PCR儀中進行，反應時間為60 min。反應結束后80°C加熱2 min，之后取出反應管，各取2 μ L Lamp產物樣品核酸電泳，電泳結果通過紫外凝膠成像系統進行檢測并拍照。檢測結果見圖4。
結果顯示，山羊痘病毒lamp引物在62°C下擴增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結果，擴增時間為60min。結果顯示，IO7-1O4個拷貝的模板均有特異性產物產生，隨著模板量的減少，產物條帶變暗。對照組無條帶產生，此圖可看出本發明所設計的山羊痘病毒lamp引物在62°C下,擴增60min之后最少可檢出IO4個拷貝的模板。
綜上可見，這里設計 合成的4個基因序列以及其形成的LAMP方法可以單獨在使用快速檢測山羊痘病毒。
權利要求
1.用于檢測山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于試劑盒中至少包括有四條引物，分別是SEQ Na 1、SEQ Na 2、SEQ Na 3 和 SEQ Na 4。
2.根據權利要求
1所述的用于檢測山羊痘病毒的試劑盒，其特征在于試劑盒內還有dNTP、Tris-HC 、KCl、(NH4) 2S04、MgS04、Tween 20 和 Bst 酶，以及模板 DNA。
專利摘要
本發明公開一種用于檢測山羊痘病毒的試劑盒。本發明的試劑盒中至少包括有SEQ№1、SEQ№2、SEQ№3和SEQ№4四條引物，試劑盒內還有dNTP、Tris-HC、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween20和Bst酶，以及模板DNA。本發明的引物具有特異性，在同等條件下不能擴增綿羊痘病毒的核酸，同時本發明的檢測靈敏度較高，同時具有檢測操作相對簡單的、快速的優點。
文檔編號C12R1/93GKCN103215385SQ201310161817
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月4日
發明者張強, 趙志荀, 范斌, 吳國華, 顏新敏, 李健, 朱海霞, 蘆曉立, 孫曉林, 劉發央 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan