專利名稱:一種采用分段梯度供氧方式發酵生產l-谷氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵領域，特別是涉及一種發酵生產L-谷氨酸的方法。
背景技術：
目前發酵法是生產谷氨酸的主要方法，其生產菌種主要包括谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、天津短桿菌(Brevibacterium tianjinese)、純齒棒桿菌(Corynebaclerium crenalum)、北京棒桿菌(Corynebaclerium pekinense)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)以及它們的突變株等。然而,谷氨酸發酵的生產水平除了取決于菌種本身的性能外，還必須給予其合適的環境條件才能夠更加充分地發揮及表現出它們優良的生產能力，如培養基組成、溫度、溶氧、補料等。
申請號為91107357.4的中國發明專利公開了一種L-谷氨酸發酵新工藝，為了同時提高L-谷氨酸發酵的產酸率及轉化率，將發酵過程分割為菌體生長和產酸兩個階段，并用不同濃度的營養液(有機氮源和無機鹽)分別加以控制，使菌體生長所消耗的糖盡量降低，使糖代謝的流向盡量轉向有利于L-谷氨酸的合成，并使細胞透性增大，使產酸率達到
9-11%，總投入糖的轉化率達到58-64%，然而其產酸率相對較低。
亞適量指微生物所處生長素濃度比其正常成長需要的濃度略低，但卻對大量合成工藝需求產品有益的現象，亞適量工藝被廣泛應用到谷氨酸發酵中。生物素作為生長因子主要影響細胞膜通透性和菌體的代謝途徑，而生物素濃度對菌體生長和谷氨酸積累均有影響。由于大量合成谷氨酸需要菌體代謝異常化，實際所需要的生物素濃度比菌體生長的需要量低，因此通過限制培養基中生物 素的濃度(亞適量)，使磷脂合成不足，細胞膜通透性提高，有利于谷氨酸的分泌。
授權公告號為CN1049689C的中國發明專利公開了一種更經濟和更有效地通過發酵工業制備L-谷氨酸的方法，其在含有濃度為10至1000 μ g/1的生物素而不加入抑制生物素活性的物質的液體營養培養基中培養能產生L-谷氨酸的短桿菌屬和棒狀桿菌屬的微生物的突變株，在培養液中產生并大量積累L-谷氨酸。
除了采用亞適量工藝外，影響谷氨酸分泌的方法還包括:在培養基中添加表面活性劑或飽和脂肪酸可抵制脂肪酸的合成，從而影響磷脂合成；采用溫度敏感型突變株，使其細胞膜的結構基因發生改變，使細胞膜不完整；添加青霉素、抗生素抵制糖肽轉肽酶的合成，從而影響細胞壁糖肽的生物合成，形成不完全的細胞壁，增加膜的滲透性等。
如公開號為CN101457243A的中國發明專利公開了一種提高L-谷氨酸發酵產率的新工藝，根據甜菜堿具有提供甲基、調節體內滲透壓、促進脂肪代謝和蛋白質合成等作用，提高酶活，促進菌體生長，實現產物在發酵液中的更大程度蓄積從而提高產率的原理，采用在發酵培養基中添加甜菜堿的方法來有效提高L-谷氨酸發酵產率。
谷氨酸生產菌為好氧菌，其對培養基中的溶解氧濃度有一個最低的要求，在此溶解氧濃度以下，其呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降。由于氧難溶于水，從而使谷氨酸發酵過程中氧的利用率低，僅為40%-60%。因此，氧的供應對谷氨酸發酵來說是一個關鍵因素，其不僅對菌體的生長和代謝產物的積累都有很大的影響，還直接關系到谷氨酸發酵的成敗，研究供氧問題，對谷氨酸發酵工藝管理的最佳化和工藝過程的放大具有重要意義。
發明內容
本發明的首要目的是針對上述現有技術存在的問題提供一種采用分段梯度供氧方式控制谷氨酸發酵過程中溶氧濃度來發酵生產L-谷氨酸的方法。本發明發酵過程中氧的傳遞速率和利用率有所提高，并且發酵后L-谷氨酸的產量和糖酸轉化率均有所提高，而發酵副產物乳酸大幅度下降。
為了達到上述目的，本發明一方面提供一種發酵生產L-谷氨酸的方法，將谷氨酸生產菌接種至發酵培養基中進行發酵，采用分段梯度供氧方式控制所述發酵的發酵液中的溶氧濃度，制得L-谷氨酸。
其中，所述分段梯度供氧方式具體包括:控制所述谷氨酸生產菌在其生長抑制期至對數生長期發酵液中的溶氧濃度為25-50%，優選為25-40%，進一步優選為25-35% ;所述谷氨酸生產菌在其轉型期發酵液中的溶氧濃度為10-25%，優選為10-20%，進一步優選為
10-15%;所述谷氨酸生產菌在其產酸期發酵液中的溶氧濃度為1-10%，優選為1-5%，進一步優選為2-5%。
特別是，所述生長抑制期至對數生長期為發酵0_6h，此階段菌體大量生長，所需溶氧濃度大；所述轉型期為發酵6-10h，此階段生長菌體和產酸，耗氧量大，但溶氧要開始降低，防止菌體過快衰老；所述產酸期為發酵IOh至發酵終止，此階段用于產酸，含氧量明顯降低，溶氧控制在較低水平，可維持較長時間的產酸期。
尤其是，在發酵過程中通過調節通氣量和攪拌轉速來進行所述分段供氧，其中控制初始通氣量為l_2L/min，攪拌轉速為500r/min_880r/min。
其中,所述 谷氨酸生產菌選自天津短桿菌(Corynebacterium tianjin)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、純齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)中的一種。
特別是，所述谷氨酸生產菌優選為谷氨酸棒桿菌GKG-9、北京棒桿菌ASl.299、鈍齒棒桿菌ASl.542、天津短桿菌T613中的一種；進一步優選為谷氨酸棒桿菌GKG-9，其保藏于天津科技大學微生物菌種保藏管理中心，公眾可以購買獲得。
其中，所述發酵培養基的配方為:葡萄糖70_90g/L，Na2HPO4.12H201_5g/L，VB10.1-lmg/L, MgSO4.7Η200.5_2g/L，MnSO4.H201_3mg/L，FeSO4.7H201_3mg/L，KCll_3g/L，玉米漿l_5mL/L，糖蜜0.5-2g/L，發酵培養基的pH值為7.0-7.2。
特別是，所述發酵培養基的配方優選為:葡萄糖80g/L，Na2HPO4.12H202.5g/L，VB10.4mg/L, MgSO4.7H201g/L, MnSO4.H202mg/L, FeSO4.7H202mg/L, KCll.3g/L,玉米漿 3mL/L，糖蜜 1.lg/Lo
其中，所述發酵為補料分批發酵；采用補料分批發酵可以避免在分批發酵中因一次投料過多而產生的底物抑制、產物反饋抑制及分解代謝物阻遏等作用，從而減少菌體生
長量及提高糖酸轉化率。
特別是，所述補料分批發酵具體包括:視所述發酵的發酵液中殘留葡萄糖的情況來流加葡萄糖溶液，使發酵液中的葡萄糖濃度維持在1.0-2.0%，其中所述葡萄糖溶液的濃度為80-90wt%。較低的殘糖濃度可使發酵液具有低的滲透壓，從而有利于谷氨酸向胞外分泌。
尤其是，自發酵液中殘留葡萄糖的濃度為5-2%時開始流加所述葡萄糖溶液，優選自發酵液中殘留葡萄糖的濃度為3-2%時開始流加所述葡萄糖溶液。
其中，采用間隔升溫方式控制所述發酵的溫度，所述間隔升溫具體包括:控制發酵的起始溫度為34°C，并且自發酵開始后每間隔4h使發酵溫度升高0.5°C。由于谷氨酸發酵屬于II型，而谷氨酸棒桿菌GDK-9為溫度敏感型菌種，因此溫度的控制既是菌體生長所需，也是細胞轉型和產酸的關鍵。本發明采用間隔升溫，使細胞逐漸從生長型轉變為產酸型，從而避免了因原料的影響而造成產酸不穩定的現象，有利于L-谷氨酸的大量積累。
其中，所述發酵還包括:流加一定濃度的氨水，使發酵液的pH維持在7.0-7.4。特別是，所述氨水的濃度為20-30%，優選為25%。
特別是，所述發酵還包括:根據發酵罐中的泡沫情況流加15-25%，優選為20%的泡敵進行消泡。
其中，所述方法具體包括:先將所述谷氨酸生產菌接種于斜面培養基上活化12-16h至長出菌苔，然后 將所述菌苔接種于種子培養基中培養至對數生長中后期，得到種子液；再將所述種子液以一定的接種量接種至發酵培養基中，并在攪拌的方式下進行發酵，采用分段梯度供氧方式控制所述發酵的發酵液中的溶氧濃度，制得L-谷氨酸。
特別是，所述種子培養基的配方為:葡萄糖20_40g/L，玉米漿30_50mL/L，豆柏水解液 5-15mL/L, K2HPO4.3Η200.5_2g/L，MgSO4.7Η200.1-lg/L，尿素 l_5g/L，pH7.0-7.2 ;優選為葡萄糖 30g/L，玉米漿 40mL/L，豆柏水解液 10mL/L，K2HPO4.3Η201.0g/L, MgSO4.7H200.5g/L，尿素3g/L ;所述接種量為5-15%，優選為10% ;所述攪拌的速度為500r/min-880r/min，優選為 500-600r/min。
與現有技術相比，本發明具有以下優點:
1、本發明的發酵方法只需設置溶氧梯度，發酵過程中的其它相關參數均可以由發酵罐控制器進行自動控制，操作不僅簡單易行，而且有利于發酵工藝的放大以及實現谷氨酸工業化大規模生產；
2、本發明的發酵過程中氧的傳遞速率和利用率高、發酵所需的周期短，從而有利于降低動力費和操作費，提高經濟效率；
3、本發明根據谷氨酸生長菌的生長和代謝特性來控制其發酵工藝，在菌體生長期的供氧不僅滿足菌體生長，還有效避免了乳酸等副產物的積累及菌體老化速率的加快，發酵后谷氨酸的產量高、糖酸轉化率高，副產物乳酸含量低。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
實施例1
1、培養基配制[0033]斜面培養基(g/L):蛋白胨10，酵母粉 5，NaC12.5，瓊脂 30，pH7.0-7.2,0.1MPa 滅菌 30min ；
種子培養基:葡萄糖30g/L，玉米漿40mL/L，豆柏水解液10mL/L，K2HPO4.3Η201.0g/L, MgSO4.7Η200.5g/L，尿素 3g/L, ρΗ7.0-7.2,0.1Mpa 滅菌 15min ；
發酵培養基:葡萄糖80g/L，Na2HPO4.12H202.5g/L，VB10.4mg/L，MgSO4.7H201g/L,MnSO4.H202mg/L, FeSO4.7H202mg/L, KCll.3g/L,玉米漿 3ml/L,糖蜜 1.1 g/L,培養基 pH 值為 7.0 7.2,0.1Mpa 滅菌 15min ；
2、發酵
將谷氨酸棒桿菌GKG-9接種于上述斜面培養基中進行活化，于32°C下培養20h長出菌苔；
從新鮮活化的斜面上挑取菌苔，接種于上述種子培養基中，于37°C、200r/min下振蕩培養7-8h，制得種子液；
以10%的接種量將上述種子液接種至裝有發酵培養基的5L發酵罐中，控制發酵罐起始培養溫度為34°C，之后間隔4h升溫0.5°C，采用分段梯度供氧方式控制所述發酵的發酵液中的溶氧濃度，設置初始通氣量為1.5L/min，初始攪拌轉速為600r/min，并且通過控制通氣量(l_2L/min)和攪拌速度(500_880r/min)使谷氨酸棒桿菌GKG-9在其生長抑制期至對數生長期發酵液中的溶氧濃度為30-35%，所述谷氨酸生產菌在其轉型期發酵液中的溶氧濃度維持在10-15%，所述谷氨酸生產菌在其產酸期發酵液中的溶氧濃度為2-5%，發酵過程中自動流加25%的氨水控制發酵液的pH在7.0-7.2，根據發酵罐中的泡沫情況流加20%的泡敵進行消泡，當發酵液中的殘糖含量降至2%左右時流加80%的葡萄糖溶液，使發酵液中葡萄糖濃度維持在1.0-2.0%的范圍內；
·[0040]采用SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析儀測定葡萄糖、L-谷氨酸及L-乳糖的含量，其中發酵培養28h后，L-谷氨酸的產量為158g/L，糖酸轉化率為64.7%，副產物L-乳酸的產量為1.0g/L。
實施例2
斜面培養基和種子培養基配方同實施例1 ;
發酵培養基:葡萄糖75g/L，Na2HPO4.12Η202.5g/L，VBJmg/L, MgSO4.7Η201.5g/L，MnSO4.H201mg/L, FeSO4.7H203mg/L, KC12g/L，玉米漿 4ml/L，糖蜜 1.8g/L，培養基 pH 值為
7.0 7.2,0.1Mpa 滅菌 15min ；
發酵過程中除接種量為5%，采用分段梯度供氧方式控制所述發酵的發酵液中的溶氧濃度，設置初始通氣量為lL/min，初始攪拌轉速為500r/min，并且通過控制通氣量(l-2L/min)和攪拌速度(500_880r/min)使谷氨酸棒桿菌GKG-9在其生長抑制期至對數生長期發酵液中的溶氧濃度為25-30%，所述谷氨酸生產菌在其轉型期發酵液中的溶氧濃度維持在15-20%，所述谷氨酸生產菌在其產酸期發酵液中的溶氧濃度為1-5%外，其余均與實施例I相同；發酵30h后，L-谷氨酸的產量為155g/L，糖酸轉化率為64.1%，副產物L-乳酸的產量為1.lg/L0
實施例3
斜面培養基和種子培養基配方同實施例1 ;
發酵培養基:葡萄糖90g/L，Na2HPO4.12H201g/L, VB10.lmg/L, MgSO4.7H200.5g/L，MnSO4.Η202.5mg/L, FeSO4.7Η201.5mg/L，KCllg/L，玉米漿 2ml/L，糖蜜 0.5g/L，培養基 pH 值為 7.0 7.2,0.1Mpa 滅菌 15min ；
發酵過程中除接種量為15%，采用分段梯度供氧方式控制所述發酵的發酵液中的溶氧濃度，設置初始通氣量為2L/min，初始攪拌轉速為800r/min，并且通過控制通氣量(l-2L/min)和攪拌速度(500_880r/min)使谷氨酸棒桿菌GKG-9在其生長抑制期至對數生長期發酵液中的溶氧濃度為40-45%，所述谷氨酸生產菌在其轉型期發酵液中的溶氧濃度維持在20-25%，所述谷氨酸生產菌在其產酸期發酵液中的溶氧濃度為5-10%外，其余均與實施例I相同；發酵28h后，L-谷氨酸的產量為160g/L，糖酸轉化率為64.9%，副產物L-乳酸的產量為1.0g/L。
實施例4
除采用天津短桿菌T613 (購自天津工業微生物研究所)進行發酵外，其余均與實施例I相同，發酵培養28h后，L-谷氨酸的產量為152g/L，糖酸轉化率為63.5%，副產物L-乳酸的產量為1.8g/L。
對照例1GKG-9高溶氧發酵
發酵過程中除通過控制通氣量(l_2L/min)和攪拌速度(500_880r/min)使發酵液中的溶氧濃度維持在40-45%外，其它發酵工藝控制同實施例1，發酵28h后，L-谷氨酸的產量為140g/L，糖酸轉化率為60.8%，副產物L-乳酸的產量為6.0g/L。
對照例2GKG-9低溶氧發酵
發酵過程中除通過控制通氣量(l_2L/min)和攪拌速度(500_880r/min)使發酵液中的溶氧濃度維持在10 -15%外，其它發酵工藝控制同實施例1，發酵28h后，L-谷氨酸的產量為132g/L，糖酸轉化率為58.0%，副產物L-乳酸的產量為9.0g/L。
對照例3T613高溶氧發酵
發酵過程中除通過控制通氣量(l_2L/min)和攪拌速度(500_880r/min)使發酵液中的溶氧濃度維持在40-45%外，其它發酵工藝控制同實施例4，發酵28h后，L-谷氨酸的產量為137g/L，糖酸轉化率為58.6%，副產物L-乳酸的產量為6.5g/L。
對照例4T613低溶氧發酵
發酵過程中除通過控制通氣量(l_2L/min)和攪拌速度(500_880r/min)使發酵液中的溶氧濃度維持在10-15%外，其它發酵工藝控制同實施例4，發酵28h后，L-谷氨酸的產量為130g/L，糖酸轉化率為57.1%，副產物L-乳酸的產量為9.2g/L。
對照例5 —次升溫發酵
發酵過程中除升溫方式采用一次升溫(即初始發酵溫度為34°C，在發酵24h時升溫至37°C)外，其它發酵工藝控制同實施例1，發酵28h后，L-谷氨酸的產量為142g/L，糖酸轉化率為61.0%，副產物L-乳酸的產量為5.0g/L。
由上述對照例結果可知:
1、采用本發明分段梯度供氧方式進行發酵，GKG-9發酵后L-谷氨酸的產量達到155g/L以上，糖酸轉化率提高至64%以上，副產物乳酸產量低至1.0g/L。
2、與維持高溶氧發酵相比，L-谷氨酸的產量提高了 10.7-14.3%，糖酸轉化率提高了 5.4-6.7%，副產物L-乳酸降低了約83.3% ;與維持低溶氧發酵相比，L-谷氨酸的產量提高了 17.4-21.2%，糖酸轉化率提高了 10.5-11.9%，副產物L-乳酸降低了約88.9%。[0064]3、與一次升溫發酵相比，L-谷氨酸的產量提高了 9.2-12.7%，糖酸轉化率提高了 5.1-6.4%，副產物L-乳酸降低了約80%。
權利要求
1.一種發酵生產L-谷氨酸的方法，其特征在于，將谷氨酸生產菌接種至發酵培養基中進行發酵，采用分段梯度供氧方式控制所述發酵的發酵液中的溶氧濃度，制得L-谷氨酸。
2.如權利要求
1所述的方法，其特征在于，所述分段梯度供氧方式具體包括:控制所述谷氨酸生產菌在其生長抑制期至對數生長期發酵液中的溶氧濃度為25-50%，所述谷氨酸生產菌在其轉型期發酵液中的溶氧濃度為10-25%，所述谷氨酸生產菌在其產酸期發酵液中的溶氧濃度為1_10%。
3.如權利要求
2所述的方法，其特征在于，所述生長抑制期至對數生長期為發酵0-6h，所述轉型期為發酵6-10h，所述產酸期為發酵IOh至發酵結束。
4.如權利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸生產菌選自天津短桿菌、北京棒桿菌、谷氨酸棒桿菌、鈍齒棒桿菌、黃色短桿菌中的一種。
5.如權利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸生產菌為谷氨酸棒桿菌GKG-9。
6.如權利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的配方為:葡萄糖70-90g/L, Na2HPO4.12H201_5g/L，VB10.1-lmg/L，MgSO4.7H200.5_2g/L，MnSO4.H201_3mg/L，FeSO4.7H201-3mg/L, KCll_3g/L，玉米漿 l_5mL/L，糖蜜 0.5_2g/L，發酵培養基的 pH 值為7.0-7.2。
7.如權利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述發酵為補料分批發酵。
8.如權利要求
7所述的方法，其特征在于，所述補料分批發酵具體包括:視發酵液中殘留葡萄糖的情況來流加葡萄糖溶液，使發酵液中的葡萄糖濃度維持在1.0-2.0%。
9.如權利要求
1或2所述的方法， 其特征在于，采用間隔升溫方式控制所述發酵的溫度，其中所述間隔升溫具體包括:控制發酵的起始溫度為34°C，并且自發酵開始后每間隔4h使發酵溫度升高0.5°C。
10.如權利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述發酵還包括:流加一定濃度的氨水，使發酵液的PH維持在7.0-7.2。
專利摘要
本發明公開了一種發酵生產L-谷氨酸的方法，將谷氨酸生產菌接種至發酵培養基中進行發酵，采用分段梯度供氧方式控制所述發酵的發酵液中的溶氧濃度，制得L-谷氨酸。本發明方法通過在谷氨酸生產菌發酵的抑制期、對數生長期、轉型期和產酸期分別采用不同的溶氧濃度進行控制，并且通過補料分批發酵，使L-谷氨酸的產量達到155g/L以上，糖酸轉化率提高至64%以上，此外發酵過程中的副產物乳酸大幅度下降。
文檔編號C12P13/14GKCN103215323SQ201310127511
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月12日
發明者邱博, 謝希賢, 張成林, 萬紅兵, 歐陽宇紅, 曹文杰 申請人:北京輕發生物技術中心, 天津科技大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan