專利名稱:一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒強弱毒的納米pcr檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測豬偽狂犬病病毒強弱毒的PCR檢測試劑盒及其應用，特別涉及一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒強弱毒的納米PCR檢測試劑盒及其應用，本發明屬于預防獸醫學檢驗領域。
背景技術：
偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus, PRV)能引起多種家畜和野生動物以發熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的疾病。豬是PRV的貯存宿主和傳染源，主要引起妊娠期母豬流產，死產和木乃伊胎；初生仔豬多為急性致死性型，具有明顯的神經癥狀，死亡率幾乎為100%;成年豬多呈潛伏感染。豬偽狂犬病幾乎在世界所有主要養豬生產地區都有發現。在我國，二十多個省、市、自治區都有本病的感染，并導致了嚴重的經濟損失。由于大部分豬場對該病有高度的認識，且采取了各種有效的綜合防治措施，使得該病的大面積暴發流行得到了有效控制。但是，仍然有少部分豬場對該病的危害性認識不夠，沒有采取有效的預防措施，典型豬偽狂犬病仍然可見。2011年開始在我國廣泛發生、流行的豬偽狂犬病，造成了大批仔豬因拉稀、消瘦、脫水而死亡。
在沒有進行過豬偽狂犬病疫苗免疫的豬場，豬偽狂犬病野毒感染后，豬群在臨床上表現典型的豬偽狂犬病癥狀:0-4周齡哺乳仔豬感染后發病最為嚴重，為最急性型，表現為體溫升高、水樣腹瀉(黃色稀便)、嘔吐、發抖、流涎、頸部肌肉僵硬、運動不協調、四肢劃水樣運動，最后昏迷死亡，初生仔豬發病率和死亡率為100%，4周齡仔豬的死亡率下降到40%-60%;斷奶后仔豬的發病率和死亡率都比哺乳仔豬低，其臨床癥狀主要表現為體溫升高、腹瀉和嚴重的呼吸困難；育肥豬感染后大多數伴有體溫升高、呼吸困難，一般不發生死亡，耐過后呈長期隱性感染帶毒或排毒；妊娠母豬感染后表現出嚴重的繁殖障礙綜合征:母豬群中重新發情、復配的比例高，有相當一部分母豬發生流產，部分母豬產死胎或木乃伊胎，或者產出弱仔和死仔。
在進行過豬偽狂犬病疫苗免疫的豬場，由于所選擇的疫苗不合適，免疫程序安排不恰當，以及其他諸多因素，還有相當一部分豬場的豬群在野毒感染后出現零星的豬偽狂犬病病例。哺乳仔豬有零星的病豬出現，經常可見嚴重水樣腹瀉，偶爾可見特征性神經癥狀病豬，斷奶前仔豬的死亡率最高可達15% ;斷奶后仔豬主要表現體溫升高、腹瀉和呼吸困難；育肥豬仍然表現體溫升高、呼吸困難，豬群整齊度比較差；母豬群中有一定比例的母豬重新發情、復配，有少數母豬發生流產、產死胎或木乃伊胎、或者產出弱仔和死仔。
PRV的抗原檢測方法很多，如病毒分離、熒光定量PCR、膠體金抗原檢測試紙條。但病毒分離耗時費力，熒光定量PCR檢測成本高且需要借助一些特殊的試驗儀器的輔助才能完成，膠體金抗原檢測試紙條雖然快速但敏感性不高。為此，本發明運用納米PCR技術，根據中國境內使用的各 種豬用PRV基因工程弱毒疫苗株均缺失gE基因這一特征，成功建立了一種新型的納米PRV強弱毒鑒別診斷試劑盒，為PRV感染的早期快速診斷提供了有力的檢測工具。
發明內容
本發明的目的在于提供一種快速檢測和鑒別豬偽狂犬病病毒(PRV)弱毒株和野毒株的新型納米PCR檢測試劑盒，以解決使用現有試劑盒進行檢測時存在的耗時長、繁瑣等缺點，且克服了因PRV存在潛伏感染性，有時會出現漏檢的問題。
為了達到以上目的本發明采用的技術措施為:
本發明的一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒(PRV)強弱毒的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于其組成成分包括:2XNano PCR緩沖液，DNA聚合酶，引物混合物，無核酸ddH20，其中所述的引物混合物由3對引物組成，第I對引物的序列分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第2對引物的序列分別為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示，第3對引物的序列分別為SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。
引物的設計是根據GenBank上已經發表的PRV參考毒株(GeBank序列號:NC_006151)gB, gE和gG基因的保守區序列，設計出納米PCR特異性引物。
在本發明中，優選的，所述的引物混合物由3對引物按照等摩爾比組成。
為了達到更好的檢測效果，所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于還包括偽狂犬病病毒野毒的陽性對照質粒及PRV gE缺失疫苗株陽性對照質粒，統稱為模板質粒。
優選的，所述的偽狂犬病病毒野毒的陽性對照質粒為含有PRV gE基因及/或含有PRV gB基因的質粒；所述的PRV gE缺失疫苗株陽性對照質粒為含有PRV gG基因及/或含有PRV gB基因的質粒。
在本發明的一個具體實施例中，本發明首先根據PRV參考毒株NC0061511株gE基因、gB基因和gG基因的保守區序列設計了引物，gE基因保守基因序列為PRV野毒所共有，而gE基因缺失疫苗株則沒有。gB基因以及gG基因為gE缺失疫苗株與野毒株所共有。
在本發明的一個具體實施例中，含有PRV gE基因及含有PRV gB基因的質粒為分別為PRV-pMD18-T-gE質粒及PRV-pMD18_T-gB質粒；所述的PRV gE缺失疫苗株陽性對照質粒為PRV-pMD18-T-gG。其中PRV-pMD18_T-gE質粒以及PRV-pMD18_T-gG質粒按照公開號為CN101831506A，發明名稱為“鑒別PRV gE缺失疫苗株和野毒株的試劑盒”的專利申請中記載的方法制備。
PRV-pMD18-T_gB質粒的構建方法如下:首先合成PRV-gB基因的引物，引物序列如下:
PRV-gB-上游:CTACAGGGCGTCGGGGTCC (SEQ ID NO: 7)
PRV-gB-下游:ATGCCCGCTGGTGGCGGTC (SEQ ID NO:8)
以PRV野毒PRV-BJ株(也可以從市場上購買，例如:中國獸醫微生物菌種保藏管理中心)DNA為模板，PCR擴增目的片段，然后分別膠回收目的片段，克隆到PMD18T載體上，然后轉化DH5ci感受態細胞，篩選陽性菌落，搖菌擴增，質粒提取試劑盒提取目的質粒。構建的質粒易保存，不具有感染性，無散毒的危險性，可以替代全病毒的DNA作為陽性模板。
在本發明中，優選的，所述的納米PCR檢測試劑盒還含有穩定劑，更優選的，所述的穩定劑為二甲基亞砜 (DMSO)。
進一步的，本發明還提出了所述的納米PCR檢測試劑盒在制備鑒別豬偽狂犬病病毒(PRV)野毒株及PRV gE基因缺失疫苗株試劑中的應用。及
所述的納米PCR檢測試劑盒在制備診斷豬偽狂犬病病毒(PRV)野毒株及PRVgE基因缺失疫苗株試劑中的應用。
優選的，本發明檢測試劑盒的各組成成分的體積及保存條件如下:
權利要求
1.一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒(PRV)強弱毒的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于其組成成分包括:2XNano PCR緩沖液，DNA聚合酶，引物混合物，無核酸ddH20，其中所述的引物混合物由3對引物組成，第I對引物的序列分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，第2對引物的序列分別為SEQ ID N0:3和SEQID NO:4所示，第3對引物的序列分別為 SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 所示。
2.按照權利要求
1所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的引物混合物由3對引物按照等摩爾比組成。
3.按照權利要求
1或2所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于還包括偽狂犬病病毒野毒的陽性對照質粒及PRV gE基因缺失疫苗株陽性對照質粒。
4.按照權利要求
3所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的偽狂犬病病毒野毒的陽性對照質粒為含有PRV gE基因及/或含有PRV gB基因的質粒；所述的PRV gE基因缺失疫苗株陽性對照質粒為含有PRV gG基因及/或含有PRV gB基因的質粒。
5.按照權利要求
1所述的納米PCR檢測試劑盒，其特征在于還含有穩定劑。
6.按照權利要求
5所述的納米PC R檢測試劑盒，其特征在于所述的穩定劑為二甲基亞砜(DMSO)。
7.權利要求
1-6任一項所述的納米PCR檢測試劑盒在制備鑒別豬偽狂犬病病毒(PRV)野毒株及PRV gE基因缺失疫苗株試劑中的應用。
8.權利要求
1-6任一項所述的納米PCR檢測試劑盒在制備診斷豬偽狂犬病病毒(PRV)野毒株及PRV gE基因缺失疫苗株試劑中的應用。
專利摘要
本發明公開了一種快速鑒別和診斷豬偽狂犬病病毒強弱毒的納米PCR檢測試劑盒及其應用，該試劑盒包括2×Nano PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶，引物混合物，DNA聚合酶，無核酸ddH2O。為了達到更好的檢測效果，本發明的試劑盒還可以含有模板混合物以及穩定劑。本發明試劑盒解決了使用現有試劑盒檢測耗時長，繁瑣、敏感性低的缺點，提高了敏感性，做到早期快速檢出病毒。本發明試劑盒具有特異性強、靈敏度高，適于早期快速診斷等特點，并且可以鑒別基因缺失株與野毒株感染。同時，本試劑盒能廣泛應于基層獸醫檢測機構，對規模化養豬場PRV的檢測、確診及鑒別診斷有重要意義。
文檔編號C12Q1/70GKCN103224995SQ201310123092
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月10日
發明者崔尚金, 仇錚 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan